Caracterização parcial da toxina citoletal distensora (CLTD) de escherichia coli
Alessandra Roque Pancetti
DISSERTAÇÃO
Português
(Broch.)
T/UNICAMP P191c
Campinas, SP : [s.n.], 1997.
83f. : il.
orientador: Domingos da Silva Leite
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia
Resumo: Neste trabalho foram pesquisadas as melhores condições de cultivo e estocagem da amostra de Escherichia coli 86-6136 para a produção da Toxina Citoletal Distensora (CLDT), assim como o melhor método de extração e purificação para a caracterização parcial da toxina. Após o que, foi realizada...
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Resumo: Neste trabalho foram pesquisadas as melhores condições de cultivo e estocagem da amostra de Escherichia coli 86-6136 para a produção da Toxina Citoletal Distensora (CLDT), assim como o melhor método de extração e purificação para a caracterização parcial da toxina. Após o que, foi realizada a produção de anticorpos neutralizantes policlonais em coelhos albinos e a análise dos efeitos citopáticos e citotóxicos da CLDT em cultura de células. O melhor meio para cultivo da amostra 86-6136 encontrado foi o "Evans Toxin Medium", pois com este meio foi verificada a produção de CLDT em ensaios de atividade citotóxica em cultura de células, com efeito semelhante ao descrito em literatura. Os estudos de obtenção da toxina demonstraram que o método mais vantajoso para a extração era a ultrasonicação do sedimento bacteriano, pois dispendia menos tempo e havia boa recuperação da atividade citotóxica, quando comparado com os outros métodos empregados, além de existir ganho no rendimento de mais de 4 vezes em atividade específica e 2 vezes em citotoxicidade, quando comparado ao sobrenadante inicial. Após a extração, o material foi submetido a diversos processos cromatográficos (Deae-Sepharose Fast-Flow; CM-Sepharose Fast-Flow; Phenil Sepharose; Sepharose CL6B; Sepharose CL4B; Superdex 200). A cromatografia que teve mais relevância para melhorar o grau de pureza da amostra foi em Sepharose CL6B. A amostra, quando submetida a cromatografia nesta resina, mostrou padrão de eluição com 3 picos, sendo que a atividade biológica estava concentrada no primeiro pico. Em eletroforese com SDS-P AGE, o material contendo atividade biológica apresentou 3 bandas, com os pesos moleculares estimados em 38,8; 37,3 e 22,4 kDa. Não foram obtidos resultados em ensaios eletroforéticos em P AGE convencional. Os ensaios cromatográficos em Sepharose CL6B resultaram em aumento de 100 vezes na citotoxicidade da amostra, e 237 vezes em atividade relativa. Os ensaios em cromatografia líquida de alta performance (HPLC) em coluna Mono-Q não permitiram a recuperação da atividade citotóxica da toxina CLDT, e por isso foram abandonados. A atividade da toxina CLDT pôde ser observada em cultura de células Vero, HeLa e CHO. Apenas nas células CHO tanto o efeito citopático quanto o citotóxico foram observados. Em ensaios em células Vero e HeLa, o efeito de distensão celular não é evidente, e em células Vero, a viabilidade celular, ao final das 120 hrs de ensaio, é bem maior em relação às outras duas linhagens. A produção de anticorpo policlonal em coelhos albinos pôde ser verificada em teste de imunodifusão radial dupla, e sua capacidade neutralizante foi observada em ensaios de soroneutralização em cultura de células CHO. Os antissoros obtidos apresentaram atividade neutralizante do efeito citotóxico da toxina CLDT no título até 1/1024
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Abstract: In this work, the best conditions of culture and stock methods of EscherichiQ coli 86-6136 strain for the production of citolethal distending toxin (CLDT), as well as its partial characterization, were studied. The production of polyclonal antibodies in rabbits and the study of citophatic...
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Abstract: In this work, the best conditions of culture and stock methods of EscherichiQ coli 86-6136 strain for the production of citolethal distending toxin (CLDT), as well as its partial characterization, were studied. The production of polyclonal antibodies in rabbits and the study of citophatic and citotoxic effects of CLDT in culture cells was determined. The best growth medium found for CLDT production was Casaminoacid- Yeast Extract CA YE), as determined by biological activity assays in culture cells. The best method for CLDT extraction was sonic disruption of the bacterial cells. Higher yield of citotoxic activity was reached when compared to other methods, in addition to 4-fold increased specific activity and 2-fold citotoxicity, compared to the initial culture supernatant. After bacterial cells disruption, the supernatant was cromatographed on several columns (Deae-Sepharose Fast-Flow; CM-Sepharose Fast-Flow; Phenil-Sepharose; Sepharose CL6B; Sepharose CL4B; Superdex 200). The best method for increasingpurity was Sepharose CL6B. The material was separated in three peaks spectrophotometrically detected (absorbance 280 nm) among these the first one displayed biological activity. On SDS-PAGE, this material exhibited three bands whose M.W. were 38.8, 37.3 and 22.4 kDa. After cromatography on Sepharose CL6B, the material displayed increased citotoxicity and relative activity of 100 and 237-fold, respectively. High-performance liquid chromatography (HPLC) on Mono-Q column resulted in unrecoverable biological activity. The CLDT biological activity could be observed in Vero, ReLa and CRO cultured cells. Only in CRO, both citophatic and citotoxic effects could be observed. In Vero and HeLa cells the cellular progressive distention could not be observed and in Vero cells cellular viability was higher than in the other cells after 120 hr. Production of polyclonal antibodies was verified in Ouchterlony test and its neutralization capability was determined in seraneutralization tests in CHO cells. The sera obtained was shown to neutralize citotoxic activity of CLDT up to the 1/1024 dilution
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