Caracterização farmacologica do relaxamento de corpo cavernoso de coelho induzido pelo veneno de Tityus serrulatus
Cleber Evandro Teixeira
DISSERTAÇÃO
Português
T/UNICAMP T235c
Campinas, SP : [s.n.], 1997.
94 f. : il.
Orientador: Edson Antunes
Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas
Resumo: Tityus serrulatus é o escorpião mais perigoso da subfamília Tityinae no Brasil devido à alta I toxicidade de seu veneno e sua vasta distribuição nos centros urbanos da região sudeste do país. As manifestações clínicas mais importantes do envenenamento humano pelo veneno de Tityus serrulatus...
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Resumo: Tityus serrulatus é o escorpião mais perigoso da subfamília Tityinae no Brasil devido à alta I toxicidade de seu veneno e sua vasta distribuição nos centros urbanos da região sudeste do país. As manifestações clínicas mais importantes do envenenamento humano pelo veneno de Tityus serrulatus são dor local intensa acompanhada de queimação no local da picada podendo durar de poucos minutos a várias horas. Estas manifestações podem ser acompanhadas por disfunções autonômicas como vômitos profusos, taquicardia, alterações pupilares, sialorréia, taquipnéia, salivação, distúrbios da pressão arterial, tremores, etc. O veneno de Tityus serrulatus atua sobre as terminações nervosas do sistema nervoso autônomo estimulando a liberação de acetilcolina ou catecolaminas de diferentes órgãos e tecidos. Os tecidos eréteis de diferentes espécies animais são inervados por fibras nervosas excitatórias adrenérgicas, inibitórias colinérgicas e inibitórias não-adrenérgicas não-colinérgicas (NANC) que, por sua vez, desempenha papel importante nos mecanismos neurais envolvidos na ereção peniana através da liberação de óxido nítrico (NO). Assim, as fontes potenciais de produção de NO em corpo cavernoso de coelho são os nervos NANC bem como o endotélio que reveste a rede de capilares sinusóides presentes no tecido cavernoso. Devido à estimulação NANC causar. O relaxamento do corpo cavernoso, investigamos os efeitos do venepo de Tityus serrulatus no corpo cavernoso de coelho. Os efeitos do veneno do escorpião Tityus serrulatus e suas frações no corpo cavernoso de coelho isolado foram investigados através de ensaios biológicos em cascata. Os tecidos foram continuamente infundidos com indometamicina ( 5,6 µM) para inibir a geração de produtos da ciclooxigenase. O veneno bruto de Tityus serrulatus (400 mg) foi purificado em coluna CM- celulose-52. Veneno de Tityus serrulatus ( 3-100 µg), acetilcolina(Ach; 0,3 - 30 nmol), e gliceril trinitrato(GNT; 0,5 - 10 nmol) relaxaram as preparações pré- contraídas pela noradrenalina(3 µM) de modo dose-dependente. Os inibidores não-específicos da NO sintase (NOS) Nw?nitro-L-arginina metil éster (LNAME; 10 µM), Nw-nitro - monometil - L - arginine (L-NMMA; 10 µM) e NG-iminoetil - L -ornitina (L - NIO; 30 µM) aumentaram o tonus dos tecidos e inibiram os relaxamentos induzidos por ACh e pelo veneno de Tityus serrulatus sem afetar aqueles induzidos pelo GTN. O efeito inibitório inibitório foi revertido pela infusão de L - arginina (300 µM), mas não D-arginina (300 µM). O inibidor da NOS neuronaI1-(2-trifluorometilfenil) imidazol (TRIM, 100 µM) não afetou o tonus nem os relaxamentos induzidos por ACh, bradicinina (Bk), veneno de Tityus serrulatus e GTN. O TRIM foi aproximadamente 1000 vezes menos potente que o L-NAME em inibir a NOS cerebelar de coelho in vitro, cuja atividade é medida pela conversão de [3H]-L-arginina para [3H]-L-citrulina. O inibidor seletivo de guanilato ciclase solúvel H-[1,2,4] oxadiazolo [4,3,-alquinoxalín-1 ona] (ODQ; 30 µM) também aumentou o tonus basal dos tecidos e aboliu os relaxamentos induzidos pelos agonistas mencionados acima. O azul de metileno (30 µM) também inibiu os relaxamentos induzidos pelo veneno, porém, ao contrário do ODQ, a inibição foi irreversível. O inibidor de proteases aprotinína (TrasylolÒ; 10 µg.ml-1), o antagonista de receptores muscarínicos atropina (1µM) e o antagonista de receptores B2 Hoe 140 (D-Arg-[Hyp3,Thi5,D-Tic7,Oic8]-BK; 50 nM) não afetaram os relaxamentos de RbCC induzidos pelo veneno de Tityus serrulatus. Bloqueadores de canais de K+ como a glibenclamida (10µM), apamina (0.1 µM), charibdotoxina (0.1 µM) e tetraetilamônio (10 µM) também não afetaram os relaxamentos induzidos pelo veneno. Capsaicina (3 e 10 nmol) relaxou os tecidos de maneira dose-dependente e não taquifilática. O vermelho de rutênio (30 µM), inibidor das respostas induzidas pela capsaicina, reduziu marcadamente os relaxamentos de RbCC causados pela capsaicina, mas não afetou aqueles induzidosos pelo veneno. L-NAME (10 11M) não apresentou efeito sobre os relaxamentos induzidos pela capsaicina. Por outro lado, o bloqueador de canais de sódio tetrodotoxina (TTX; 1 µM) aboliu os relaxamentos de RbCC induzidos pelo veneno de Tityus serrulatus sem afetaram os induzidos por capsaicina, ACh e GTN. A TTX (1µM) também reverteu prontamente a resposta do veneno quando infundido durante a fase de relaxamento. Das treze frações obtidas do veneno bruto de Tityus serrulatus, apenas as frações X, XI e XII causaram relaxamento de RbCC de modo dose-dependente, cujo efeito foi marcadamente 'inibido na presença de L-NAME (10 µM) ou tetrodotoxina (1µM). Nós propomos, portanto que o veneno de Tityus serrulatus atua seletivamente sobre as fibras NANC, possivelmente nitrérgicas, e que o NO gerado no nervo se difunde através dos terminais relaxando o músculo liso vascular adjacente. Além disso, a NOS neuronal (bNOS) já foi detectada no pênis humano e de rato usando-se anticorpos NOS específicos e imunohistoquímica. A descoberta de que o TRIM, um inibidor seletivo para a bNOS em camundongos, não afetou a liberação de NO induzida pelo veneno de Tityus serrulatus, pode, refletir sua potência reduzida sobre a enzima do coelho
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Abstract: Títyus serrufatus ís the most dangerous scorpíon of the subfamily Tityinae in Brazíl because of the high toxicity of its venom and its widespread distribution in populous urban centers of southeastern region of the country. The most important clinical manifestations of the human ...
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Abstract: Títyus serrufatus ís the most dangerous scorpíon of the subfamily Tityinae in Brazíl because of the high toxicity of its venom and its widespread distribution in populous urban centers of southeastern region of the country. The most important clinical manifestations of the human envenomation by Títyus serrulatus are intense local pain and an immediate local burning . sensation which may last from few minutes to several hours. These manifestations may be accompanied by autonomic dysfunctions such as vomiting, diaphoresis, tachycardia, mydriasis, tachypnea, excessive salivation, arterial pressure disturbances, tremors, etc. Tityus serrufatus . venom is known to act on nerve endings of the autonomic nervous system to stimulate the release of either acetylcholine or catecholamines from different organs and tissues. The erectile tissues from different animal species are innervated by adrenergic excitatory, cholinergic inhibitory and non-adrenergic non-cho!inergic (NANC) inhibitory nerve fibers which in ~ turn is believed to play a pivotal rore in the neural mechanisms involved in penile erection through the release of NO. Thus, the potential sources of NO production in the rabbit corpus cavernosum t preparation employed in this study are both NANC nerves and the endothelium covering the network of sinusoidal capillaries supplying the cavernosal tissue. Since NANC nerve stimulation . causes corpus cavernosum relaxation, we have investigated the effects of Tityu's serrulatus scorpion venom on the rabbit isolated corpus cavernosum. The effect of Tityus serrulatus scorpion venom and its fractions on the rabbit isollated corpus cavernosum (RbCC) was investigated using a bioassay cascade. The tissues were continuously infused with indomethacin (5.6 µM) to inhibit the generation of cyclooxygenase products. Dried Tityus serrufatus venom (400 mg) was purified using a CM-cellulose-52 column. Tityus serrufatus venom (3-100 1l9), acetylcholine (ACh; 0.3-30 nmol) and glyceryl trinitrate (GTN;0.5-10nmol) dose-dependently relaxed RbCC preparations precontracted with noradrenaline (3µM). The non-specific NO synthase (NOS) inhibitors Nw-nitro-L-arginine methyl ester (L-NAME; 10 µM), Nw-nitro-monomethyl-L-arginine (L-NMMA; 10 µM) and NG -iminoethyl-L-ornithine (L-NIO; . 30 µM) increased the tone of the RbCC tissues and markedly reduced both ACh- and Tityus serrulatus venom-induced RbCC relaxations without affecting those evoked by GTN. The inhibitory effect was reversed by infusion of L-arginine (300 µM), but not D-arginine (300 µM). The neuronal NOS inhibitor 1-(2-trifluoromethylphenyl) imidazole (TRIM, 100µM) affected neither the tone of the RbCC nor the relaxations induced by ACh, bradykinin (Bk), Tityus serrulatus venom and GTN. TRIM was approximately 1,000 times less potent than L-NAME in inhibiting rabbit cerebellar NOS ín vítro, as measured by the conversion of [3H]-L-arginine to [3H]-L-citrulline. The selective soluble guanylate cyclase inhibitor 1 H-[1 ,2,4] oxadiazolo [4,3,-alquinoxalin-1one] (OQD; 30 µM) also increased the basal tone of the RbCC and abolished the relaxations. induced by the agonists mentioned above. Methylene blue (30 µM) also inhibited the relaxations induced by Tityus serrulatus venom but, in contrast to OQD, the inhibition was irreversible. The protease inhibitor aprotinín (TrasylolÒ; 10µg.ml-1 the muscarini receptor antagonist atropine (1 IlM) and the bradykinín 82 receptor antagonist Hoe 140 (D-Arg-[Hyp3,Thi5,D-Tie, Oic8]-BK; 50 nM) did not affect the RbCC relaxations induced by Tityus serrulatus venom. Potassium channel antagonists such as glybenclamide (10 µM), apamin (0.1 µM), charybdotoxin (0.1 µM) and . tetraethylammonium (10 µM) also failed to affect the venom-induced relaxations. Capsaicin (3 and 10 nmol) relaxed the RbCC tissues in a dose-dependent and non tachyphylactic manner. Ruthenium red (30 µM), an inhibitor of capsaicin-induced responses, markedly reduced the RbCC relaxations caused by capsaicin, but failed to affect the RbCC . relaxations induced by Tityus serrulatus venom. L-NAME (10 µM) had no effect on the capsaicin induced RbCC relaxations. On the other hand, the sodium channel blocker tetrodotoxin (TTX; 1µM) abolisheçi the RbCC relaxations induced by Tityus serrulatus venom without affecting those evoked by capsaicin, ACh and GTN. Tetrodotoxin (1 µM) also promptly reversed the response to the venom when infused during the relaxation phase.The bioassay cascade of thirteen different toxin components purified from the Whole venom revealed that only fractions X, XI and XII caused dose-dependent RbCC relaxations and this was markedly reduced by either TTX (1 µM) or L-NAME (10 µM). We propose therefore that Tityus serrulatus venom acts selectively on NANC fibers, possibly nitrergic nerves, and that the NO generated in the nerve diffuses through the nerve endings to relax the adjacent vascular smooth muscle. Indeed, neuronal NOS (bNOS) has been detected in both the rat and human penis using an specific NOS antibody and immunohistochemistry. The findings that TRIM, a specific neuronal NOS inhibitor in the mouse, did not affect the NO release induced by Tityus serrulatus venom, may reflect its reduced potency on the rabbit enzyme
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