Resumo: Células Vero foram cultivadas sobre géis 3D de colágeno tipo I ou em lamínulas de vidro por 48h com 10% de soro fetal bovino (SFB). Após este tempo de cultivo as células passaram a ser mantidas em meio sem SFB, com 10 % de SFB, com 10 % de SFB mais dexametasona (DEX) e com 20 % de SFB. Amostras foram fixadas após 48h, 120h e 240h de cultivo. Os géis foram incluidos em paraplast e cortados com 7Jlm de espessura. As amostras foram coradas com hematoxilina-eosina (HE), cresil violeta (CV), azul de toluidina (A T) e xylidine ponceau (XP). Foi realizado também imunocitoquímcia para colágeno IV (CaL IV) e para fibronectina (FN). Com as células cultivadas sobre lamínulas foram obtidos os índices mitóticos e as curvas de crescimento da cultura. Células cultivadas em colágeno por 24h, foram analizadas em microscopia eletrônica de varredura (MEV). Um ensaio em microplacas para a adesão celular com 24h de cultivo também foi realizado. As células que foram cultivadas sobre lamínulas e coradas com CV, em todos os casos analisados, mostravam morfologia irregular e com alguns prolongamentos, exceto nas regiões confluentes onde encontramos apenas células com formas poliédricas. Encontramos também a formação de grumos celulares nas amostras tratadas com DEX. Material bem corado com XP foi evidenciado tanto com 120h quanto com 240h de cultivo. Os grumos celulares nas amostras tratadas com DEX foram os pontos onde encontramos coloração mais intensa. O A T mostrou nas primeiras 48h células com citoplasma, núcleo e nucléolo metacromáticos. Com 120h de cultivo foram detectadas células com núcleos ortocromáticos, nucléolo basófilos e citoplasma levemente metacromático em quase todas as amostras, exceto nas tratadas com DEX, onde encontramos citoplasma intensamente metacromático. Com 240h de cultura encontramos células com citoplasma, núcleo e nucléolos metacromáticos (S/SFB e 10% SFB) e células com núcleos ortocromáticos, nucléolos e citoplasma metacromáticos (10% SFB+DEX e com 20% SFB). A imunocitoquímica mostrou a presença de CaL IV nas amostras mantidas S/SFB, com 10% SFB e com 20% SFB, mas não nas células cultivadas com DEX. Encontramos a presença de FN em todos os casos, porém foi encontrado um arranjo mais homogêneo nas células que cresceram na presença de 10% SFB+DEX e 20% SFB. Dados citoquímicos e imunocitoquímicos mostraram que o DEX interfere no padrão de crescimento de células sobre lamínulas. A MEV mostrou um grande espalhamento celular e deposição de material fibrilar, cuja deposição é estimulada pela variação da concentração dos componentes do SFB. O ensaio com microplacas mostrou que a adesão das células ao substrato também é estimulada pelo SFB. A análise morfológica feita com HE mostrou nos géis nas primeiras 48h uma monocamada de células achatadas, embora em alguns pontos as mesmas mostravam-se com duas ou três camadas de células arredondadas. Ambos os casos mostraram-se bem evidenciados pelo XP e as células apresentavam também metacromasia quando corado com AT. Com 120h e 240h em meio S/SFB ou com 10% de SFB, coradas com HE, foram observadas células formando um estrato com várias camadas arredondadas além de vários pontos de infiltração para o interior do substrato. Estas células apresentavam núcleos e citoplasma metacromáticos, quando corados com A T. Também encontramos granulações metacromáticas ao redor das células no interior do gel. Nesses experimentos o XP mostrou células bem coradas tanto no citoplasma como no núcleo. O gel também foi levemente corado pelo XP. As granulações presentes na matriz colagênica junto as células infiltradas também foram coradas pelo XP. A análise imunocitoquímica mostrou deposição de FN mas não de COL IV. Concluimos que nessas condições experimentais, S/SFB ou com 10% de SFB, as células cultivadas nos géis de colágeno, organizam uma estrutura semelhante a um tecido conjuntivo frouxo. Por outro lado, a HE mostrou que as células que foram tratadas com DEX (um inibidor da síntese de colagenases) e com 20% de SFB (que contém <X2-macroglobulina, um inibidor de atuação de colagenases) não invadiram a matriz colagênica, permanecendo com muitas camadas celulares, com forma arredondada na camada basal e achatada nas superiores. O A T mostrou células com núcleos e citoplasma metacromáticos, além de evidenciar uma camada acelular entre as células e o substrato. Todos as camadas celulares também foram bem coradas pelo XP. A imunocitoquímica mostrou que quando a infiltração foi bloqueada as células não produziram FN mas sim uma camada de COL IV. Os dados citoquímicos e imunocitoquímicos nos demonstraram que quando usamos inibidores de colagenases, as células Vero formam um tecido com características epiteliais e produzem uma estrutura semelhante à membrana basal Ver menos

Abstract: The Vero celIs were cultured on a colIagen I gel or a glass coverslip with 10% fetal calf serum (FCS) for 48hs. After this incubation time, samples were cultured without FCS, or with 10% FCS, 10% FCS plus dexamethasone (DEX) or 20% of FCS. Samples were harvested after 48hs, 120hs, and 240hs and fixed. The gels were embedded in paraplast and 7J.lm thick sections were obtained. The samples were stained with hematoxilin-eosin (HE), cresil violet (CV), toluidine blue (TB) and xylidine ponceau (XP). Immunocytochemical tests were carried out for colIagen IV (COL IV) and fibronectin (FN). The mitotic index and the growth curve were obtained for celIs cultured on coverslip. The celIs cultured on colIagen gels for 24hs were studied with scanning electron microscopy (SEM). An assay for celIular adhesion during 24hs was also performed on 96 welIs microplate. The celIs cultured on coverslips, stained by CV, showed an irregular morphology with celIular processes, and a poliedric form on the confluent areas in alI the celIs studied. We also found the formation of many celIular aggregates in the samples treated with DEX. AlI samples were stained with XP, after 120hs or 240hs of culture. The celIular aggregates induced by DEX were stained by XP. The TB staining showed celIs with metachromatic cytoplasm, nuc1ei and nuc1eoli in the first 48hs. With 120hs of culture we found celIs with ortochromatic nuc1ei and light metachromasy in nuc1eoli and cytoplasm. With 240hs we found celIs with metachromatic nuc1ei, nuc1eoli and cytoplasm (without FCS and with 10% FCS) and celIs with ortochromatic nuc1ei, metachromatic nuc1eoli and cytoplasm (with 10% FCS + DEX or 20% FCS). The immunocytochemical experiment showed that COL IV was present in the samples cultured without FCS or with 10% FCS and 20% FCS, but it was not found in the celIs cultured with DEX. FN was present in alI samples but in the celIs cultured with 10% FCS + DEX or 20% FCS we found a more homogeneous arrangement. Cytochemical and immunocytochemical data showed that DEX modifies the growth of Vero celIs cultured on a coverslip. The SEM showed that celIular spreading and the synthesis of fibrillar material was stimulated by FCS. The microplate assay showed that celIular adhesion to the substratum is also stimulated by changes in concentration of the serum component. The morphological study of celIs cultured on a colIagen substratum was made with HE. In the first 48hs of culture we found a monolayer of flattened celIs on the colIagen substratum. We observed also the same celIs with a round morphology growing in 2-3 layers. These celIular layers were stained with XP and showed metachromatic cytoplasm when stained with TB. CelIs cultured during 120hs or 240hs without FCS or with 10% of FCS formed many layers of rounded cells capable of invading the collagen substratum. These cells showed a metachromatic cytoplasm and basophilic nuc1ei and nuc1eoli when stained with TE. We could see some metachromatic granulations surrounding the cells in the collagen gel. In these experiments XP staining showed cells with stained cytoplasm and nuc1ei. The collagen gel was also stained with XP. The granulations present in the matrix surrounding infiltrated cells stained with XP. The immunocytochemical tests showed the prodution of FN but not COL IV. We conc1uded that in these cases, the cells form a loose connective tissue like structure. On the other hand, cells cultured with 10% FCS + DEX, a collagenase synthesis inhibitor, or with 20% FCS, which contains a2­macroglobulin, a collagenase activity inhibitor, did not invade the collagen matrix and formed a multiple cell layers, where round cells occur on the basal layers and flattened cells on higher layers. All cells of these extracts were stained with XP. TB staining showed cells with cytoplasmatic metachromasy and basophilic nuc1ei and nuc1eoli. We could see also an acellular layer stained with TB between the cell and the substratum and with a immunocytochemical method we identified in the same areas a COL IV rich region. FN was not found. These cytochemical and immunocytochemical data showed that when we use collagenase inhibitors the Vero cells form a epitheliallike tissue and produce a structure similar to a basement membrane Ver menos