Resumo: A asparaginase (ASNase-EC 3.5.1.1.) de semente imatura de ervilha (Pisum sativum L.) varo Bolero foi purificada e caracterizada. A ASNase foi dependente de K+ para sua ativação e a presença de íons Ca2+ nos tampões de extração e purificaçcão permitiu uma maior recuperação da atividade da enzima. O Ca2+ pode auxiliar na manutenção da estrutura ativa da enzima. A ASNase apresentou duas isoformas, eluídas separadamente em cromatografia de exclusão. A primeira de 200.000 g/mol com atividade mais baixa e a segunda, com 69.000 g/mol, com a maior atividade, sendo portanto, a principal forma da enzima. A ASNase apresentou pI de 4,5 a 5 e [(m de 2,4 mM para Asn. A enzima foi inibida competitivamente por Gly e Asp, e os resultados indicaram que o Asp seria liberado na reação após o NH4 +. Através das reações imunológicas, foi observado que anticorpo produzido contra a ASNase de semente de ervilha reconheceu bandas na mesma posição que a ASNase de ervilha em extratos de sementes de outras espécies: Crotalaria juncea, C. paulina (ambas dependentes de K+) e C. zanzibarica (independente). A ASNase de ervilha também apresentou reação cruzada com anticorpos produzidos contra ASNase de C. juncea e Lupinus polyphyllus (independente de K+), sugerindo alguma homologia entre as moléculas, e também que a parte da molécula que determina dependência ao K+ não coincide com aquela reconhecida pelo anticorpo Ver menos

Abstract: Asparaginase (ASNase-EC 3.5.1.1) from immature seed of Pisum sativum L. cv. Bolero was characterized and purified. ASNase from pea seed was dependent upon the presence of K+ for activity and the presence of Ca2+ in the extraction buffers pertmitted a higher recovery of activity. The Ca2+ ions could assist the active ASNase structure. The enzyme showed two active isoforms, eluted separately from exclusion chromatography. The first isoform (200.000 g/mol) presented lower activity and the second (69.000 gjmol) with the highest activity, was the main formo This enzyme showed a pI near to 4,5-5 and a J(m of 2,4 mM for Asn. Gly and Asp were competitive inhibitors of the enzyme. Asp would appear to be released from the enzyme after NH4 +. Western blot analysis demonstrated the presence of bands coinciding with the ASNase from pea seed in seed extract from other species: Crotalaria juncea J Crotalaria paulina (K+dependent) and Crotalaria zanzibarica (K+ -independent). ASN ase from pea seed showed a cross-reaction with antibodies against ASNase from Crotalaria juncea and Lupinus polyphyllus (K+ -independent), suggesting a similarity between the enzymes, and that the part of the molecule involved in the K+ dependency is not coincident with that recognized by the antibody Ver menos