Orientador: Konradin Metze

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas

Resumo: As regiões organizadoras do nucléolo (NORs) são áreas de DNA extra ou intranucleolares, contendo genes que codificam o RNA ribossomal. Estas regiões têm grande afinidade com a prata, em virtude da presença de proteínas não- histonas associadas ao RNA ribossomal e, por isso, são chamadas de...

Resumo: As regiões organizadoras do nucléolo (NORs) são áreas de DNA extra ou intranucleolares, contendo genes que codificam o RNA ribossomal. Estas regiões têm grande afinidade com a prata, em virtude da presença de proteínas não- histonas associadas ao RNA ribossomal e, por isso, são chamadas de AgNORs. o estudo das AgNORs tem sido utilizado predominantemente para avaliar proliferação celular, distinguir tumores malignos, de benignos, e como indicador prognóstico em neoplasias. Entretanto, a grande variedade de métodos utilizados para medir ou contar AgNORs, nos diferentes estudos, toma dificil a comparação de resultados. A escassez de trabalhos que avaliem a morfologia e a evolução das AgNORs em tecidos normais em desenvolvimento, e a falta de estudos ultra-estruturais sobre estas regiões, que poderiam contribuir para uma padronização de sua contagem, estimulou-nos a essa pesquisa.. O tecido escolhido para o estudo foi o do miocárdio de ratos em desenvolvimento intra e extra-uterino. Utilizamos o ventrículo esquerdo do coração de 95 ratos, entre o 16Q dias após a concepção e 60Q dias pós-parto, subdivididos em dois grupos: a) 16, 19 e 21 dias de vida pré-natal e b) 1,5, 8, 21 e 60 dias de vida pós-natal. Para o estudo em microscopia óptica (M. O.) utilizamos 74 animais e, para a microscopia eletrônica (M.E.), 21. O material para M. O. foi fixado em formalina tamponada 10% durante 1 hora e incluído em parafina. Os cortes de 31lm foram desparafinados e corados pela técnica de AgNOR, descrita por CROCKER & NAR (1987). Como não encontramos na literatura uma técnica para evidenciar as estruturas das AgNORs em microscopia eletrônica, desenvolvemos um procedimento novo, empiricamente, no qual não utilizamos tetróxido de ósmio, acetato de uranila e citrato de chumbo, com o intuito de assegurarmos que qualquer precipitação elétron-densa poderia ser atribuída a prata. As AgNORs foram subdivididas em "clusters" (que correspondem ao nucléolo) e pontos ("dots"). O estudo ultra-estrutural mostrou que, o "cluster" é constituído por um conjunto de precipitações de prata, interligadas entre si por faixas mais claras, dentro de uma matriz pouco elétron-densa. O "dot" é apenas uma precipitação escura, sem matriz. A partir destas observações, adotamos o critério de contar o cluster (nucléolo) como uma unidade, visto que a contagem individual de precipitações de prata, dentro dele, pareceunos pouco reproduzível e arbitrária. Os cardiomiócitos dos ratos fetais (16, 19 e 21 dias) e com 1,5 dias após o nascimento apresentaram um índice maior de "clusters" de AgNORs de grande tamanho, quando comparados com os de animais de 8, 21 e 60 dias após o nascimento. Esta diferença provavelmente está relacionada à atividade proliferativa da célula, que é maior na vida intra-uterina. O aparecimento de maior quantidade de "dots", nos animais com 60 dias de vida após o nascimento, foi interpretado como provável indicador de nova síntese protéica, necessária para o complexo miofibrilar. Qualitativamente, entre as idades de 16, 19 e 21 dias de vida intra-uterina e 1,5 dias pós-natal e entre 8, 21 e 60 dias após o nascimento, dificilmente conseguimos distinguir diferenças na estrutura morfológica dos "clusters" das AgNORs. Podemos observar diferenças em relação ao tamanho dos "clusters" das AgNORs, em todas as idades, com análise quantitativa. Em determinados núcleos dos cardiomiócitos, encontramos duas, três ou mais AgNORs alinhadas, o que chamamos de fenômeno de alinhamento. Nas idades de 1<6, 19 e 21 dias de vida intra-uterina e 1,5 pós-natal foi encontrada uma baixa porcentagem das AgNORs alinhadas, enquanto nos núcleos dos animais com 8, 21 e 60 dias ap'os o nascimento, o alinhamento das AgNORs apresentou maior freqüência e quantidade. A análise discriminante mostrou, para a separação das idades, que: a. os números dos núcleos com alinhamento das AgNORs, têm, em geral, importância maior que os números médios das AgNORs (57,3). b. dentro das variáveis que dependem do tamanho das AgNORs, as precipitações maiores que 2 J.1m são as mais importantes (36,5). Os dados morfométricos das AgNORs permitiram a determinação exata da idade do animal em 79,7% dos casos

Abstract: Nuc1eolar organizing regions (NORs) are areas of extra or intranuc1eolar DNA which harbor genes coding for ribosomal RNA. NORs have intense affinity for silver, which stains dots in the acrocentric chromosomes 13, 14, 15,20 and 21. These are called argyrophilic NORs or AgNORs. This is due...

Abstract: Nuc1eolar organizing regions (NORs) are areas of extra or intranuc1eolar DNA which harbor genes coding for ribosomal RNA. NORs have intense affinity for silver, which stains dots in the acrocentric chromosomes 13, 14, 15,20 and 21. These are called argyrophilic NORs or AgNORs. This is due to the presence of non-histone proteins associated to ribosomal RNA recently transcribed from DNA. Currently, the AgNOR technique is being employed in the evaluation of cellular proliferation, in distinguishing benign from malignant tumors and as an indicator of prognosis in malignant neoplasms. There has been considerable controversy in the criteria for measuring or counting AgNORs, making comparison of results from different authors often difficult. In an attempt to help define criteria for AgNOR measuring in light microscopy, we developed a technique for examining AgNORs in electron microscopy. A normal tissue, the rat heart left ventric1e in the fetal and postnatal periods as used. A total of95 animais were studied at the following ages: 16, 19 and 21 pre-natal days; 1, 5, 8,21 and 60 days after birth. For light microscopy 74 animais were used, and 21 for electron microscopy. For light microscopy, material was fixed in 10% buffered formalin for one hour, dehydrated and c1eared as usual and embedded in paraffin. Three f..lm sections were stained for AgNORs by the technique ofCrock~r & Nar (1987), slightly modified. As no EM technique for AgNORs was found in the literature, we developed the following procedure empirically: tissue was fixed in Karnovsky' s solution for one 110ur, followed by a quick rinse (3-5 seconds) in ethanol-acetic acid and incubated for 30 minutes in a solution containing 1 volume of 2% gelatine dissolved in 1 % formic acid and 2 volumes of 50% aqueous silver nitrate. Solution was prepared and Millipore filtered just before use. Tissue blocks were then dehydrated in ascending alcohols and embedded in Araldite. We avoided using osmium tetroxide, uranyl acetate or lead citrate to ensure that any electrondense precipitations could be reliably attributed to silver. EM revealed that an AgNOR c1uster is formed by a group of silver precipitations intermingled with lighter strands and embedded in electronlucent matrix. The clusters correspond to the nucleolus itself. An AgNOR dot is a single dark precipitation containing no matrix. Based on these observations, we adopted the criterion of counting a cluster (a nucleolus) as a single unit, since the counting of individual silver precipitations within a cluster proved unreliable and somewhat arbitrary. Exaroination of cardiomyocytes disclosed that large AgNOR clusters were more numerous in rats at 16, 19 and 21 prenatal days and 1,5 days postnatally than in animaIs at 8,21 and 60 days after birth. This difference was interpreted as probably related to a higher proliferative activity of the celIs in intrauterine life. At 60 days there was a high number of dots. This finding was thought to be a likely indicator of new protein synthesis necessary for the formation of the myofibrillary complexo On a qualitative basis, the morphological appearance of the clusters was extremely similar, if not indistinguishable, for the ages 16, 19 and 21 prenatal days and 1,5 days postnatalIy. The saroe occurred for animaIs aged 8, 21 and 60 days postnatalIy. However it was possible to distinguish clearly between these two groups on cluster morphology alone. On the other hand, inside each group quantitative analysis showed significant differences between alI ages. In some cardiomyocyte nuclei we found three or more AgNORs on a straight line, which we designated as the aIignment phenomenon. In animaIs with ages 16, 19 and 21 prenatal days and 1,5 days postnatalIy the number ofsuch lined up AgNORs was smalI, while in those of later ages the phenomenon w~ observed with higher frequency. Discriminating analysis showed that animais of different ages could be separated using morphometric data of AgNORs in 79,7 % of cases. For this effe~ the numbers of nuclei with AgNOR aIignment has a higher importance than the average AgNOR counting.IIIAmong the variables depending on the size of the AgNORs, precipitations larger than 2 I-l are most important. The high percentage of right results in age discrimination demonstrates that the technique here described is reliable and reproducible for morphometric evaluation of AgNORs