Orientador: Yong Kun Park

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos

Resumo: Quinhentos e sessenta linhagens de microrganismos foram isoladas de amostras de solo brasileiro em meio alcalofilico. Oito linhagens apresentaram alta atividade enzimática de CGTase. Dentre estas, uma linhagem identificada como Bacillus firmus n° 324 apresentou alta produtividade de...

Resumo: Quinhentos e sessenta linhagens de microrganismos foram isoladas de amostras de solo brasileiro em meio alcalofilico. Oito linhagens apresentaram alta atividade enzimática de CGTase. Dentre estas, uma linhagem identificada como Bacillus firmus n° 324 apresentou alta produtividade de cic10dextrina glicosiltransferase (E.C. 2.4.1.19). A produção ótima da enzima CGTase de Bacillus firmus n° 324 foi obtida em meio de cultura composto de 1 % de amido solúvel, 5 % de água de maceração de milho (AMM), 0,1 de % K2HPO4, 0,02 % de MgSO4 e 1% de CaCO3, a 40°C após 16 horas de fermentação. A CGTase foi purificada até homogeneidade através de ultrafiltração em membrana de 30.000 daltons, p-hidróximercuribenzoato, p-mercaptoetanol e N-bromosuccinimida não inibiram cromatografia em colunas de DEAE-Sephadex e DEAE-Sepharose CL-6B. A CGTase de Bacillus firmus n° 324 apresenta atividade ótima de formação de cic10dextrina a 65°C na faixa de pH 7,5-8,5. A enzima mostrou-se estável na faixa de pH 6,0-9,5 e a 55°C. Na presença de CaCl 1 mM a enzima permaneceu estável após 30 minutos de tratamento a 70°C. A atividade enzimática não foi afetada por MgSO4. e KCl porém foi fortemente inibida por HgCl e ZnSO4 na concentração 1 mM de sal em relação ao volume final da mistura de reação. Os reagentes EDTA, a atividade de CGTase na concentração de 5 mM em relação ao volume final da mistura de reação. o peso molecular da enzima foi estimado em 75.000 daltons através SDSP AGE electroforese. A CGTase produziu a, ß e y -ciclodextrinas a partir de amido na proporção de 1:11:5 respectivamente. O rendimento de a, ? e ?- ciclodextrina a partir de 5 % de amido solúvel foi 50 %. O rendimento de J3 e ß-ciclodextrina a partir de 5 % de amido solúvel foi de 32 e 15 %, respectivamente. Maltosil (a-l,6) a, ß e y-ciclodextrina foram sintetizadas a partir de maltose e , ß e y-ciclodextrinas, respectivamente, utilizando-se pululanase de Klebsiella sp (E.C. 3.2.1.41). Verificou-se que a puIulanase de Klebsiella sp. produziu 50,4 % de maltosil (a-l,6) a-ciclodextrina, 35 % de maltosil (a-l,6) y- ciclodextrina e 55,4 % de maltosil (a -l,6) y -ciclodextrina, após 24 horas de reação. O pH e temperatura ótima para a formação de maltosil (a -l,6) ß-ciclodextrina foram 5 e 50°C, respectivamente. Observou-se que a concentração total de substrato de 70 % e a proporção molar de 18,8 : 1 de maltose : ß-ciclodextrina foram as condições mais adequadas para a formação de maltosil (a-1,6) ß-ciclodextrina

Abstract: Five hundred and sixty strains of microorganisms were isolated from soil of Brazil using aIkalophilic culture medium. Eight strains of bacteria produced high activity of cyclodextrin glycosyltransferase (E.C. 2.4.1.19). One of these was classified as Bacillus firmus n° 324, and it...

Abstract: Five hundred and sixty strains of microorganisms were isolated from soil of Brazil using aIkalophilic culture medium. Eight strains of bacteria produced high activity of cyclodextrin glycosyltransferase (E.C. 2.4.1.19). One of these was classified as Bacillus firmus n° 324, and it demonstrated the highest CGTase activity. Highest yield of the enzyme of Bacillus firmus n° 324 was obtained by using the following medium 1 % soluble starch, 5 % com steep liquor(w/v), 0,1 % K2HPO4, 0,02 % MgSO4. 7H2O and 1 % Na2CO3 at 40° C for 16 hours incubation. The enzyme was purified to electrophoretical homogenity by ultrafiltration membrane, DEAE-Sephadex and DEAE-Sepharose CL-6B. The CGTase of Bacillus firmus n° 324 showed optimum activity for formation of cyclodextrins at 65°C and range at pH 7,5-8,5. The enzyme was stable in the range of pH 6,0-9,5 and at temperature 55°C, and at 70°C in the presence of CaCl (1 mM) after 30 min treatment. The enzyme activity was not affected by MgSO4 and KCl but it was strongly inhibited by HgCl and ZnSO4 in the final reaction concentration in 1 mM. A concentration of 5 mM of the EDTA, p-hydroxymercuribenzoate, (3mercaptoethanol and N-bromosuccinimide in the final reaction volume not inhibited the CGTase activity. The molecuIar weight of the purified enzyme was estimated to be 75.000 daltons by sodium dodecylsuIfate polyacrylamide gel electrophoresis. This enzyme produced a, 13 and y -cyclodextrin in the ratio 1: 11:5 respectively. The Yield of a , ß and y-cyclodextrin using 5 % starch solution(w/v) was 50 %. The Yield of ß and y-cyclodextrin were 32 and 15 % respectively. Maltosyl (a-l ,6) a- 13 and y-cyclodextrin was synthesized from maltose and a, 13 and ? -cyclodextrin, respectively, using KZebsiella sp. pullulanase.(EC 3.2.1.41). It was found that KZebsiella sp. pullulanase produced 50,4 % maltosyl (a-l,6) a -cyclodextrin, 35,0 % maltosyl (a-l,6) ß-cyclodextrin and 55,4 % maltosyl (a-l,6) y -cyclodextrin per ml of reaction mixture during 24 hours reaction. The optimum pH and temperature for formation of maltosyl (a-l,6) ß-cyclodextrin were 5 and 50°C respectively. It was observed that the total substrate concentration of 70 o/o{w/v) and maltose: ß-cyclodextrin molar ratio of 18,8:1 are the most suitable conditions for the formation of maltosyl (a-l,6) ß-cyclodextrin