Orientador: Mario Jose Abdalla Saad

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas

Resumo: A insulina estimula a autofosforilação do receptor, ativando a capacidade tirosina quinase deste, resultando em fosforilação do substrato I do receptor de insulina. O IRS-l fosforilado liga-se à enzima fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3-quinase), ativando-a. Nos últimos anos, demonstrou-se...

Resumo: A insulina estimula a autofosforilação do receptor, ativando a capacidade tirosina quinase deste, resultando em fosforilação do substrato I do receptor de insulina. O IRS-l fosforilado liga-se à enzima fosfatidilinositol 3-quinase (PI 3-quinase), ativando-a. Nos últimos anos, demonstrou-se que essas etapas iniciais da ação insulínica apresentam regulação tecido-específica em diferentes situações fisiopatológicas. Tais estudos, realizados em tecido muscular, hepático e adiposo, não foram efetuados em tecido renal. Assim, o objetivo do presente trabalho foi investigar os níveis e grau de fosforilação do receptor de insulina e do IRS-l, bem como a associação deste com a PI 3-quinase em tecido renal. Estes experimentos foram realizados em situações de resistência à insulina com hiperinsulinemia (ratos senis com vinte meses) ou hipoinsulinemia (ratos com diabetes induzido pela estreptozotocina e em jejum prolongado por 72 horas) e, em situações de crescimento renal (diabetes e hipertrofia contralateral compensatória secundária após o 2°, 7° e 28° dia da uninefrectomia). A metodologia utilizada envolveu infusão de insulina ou solução salina 0,9 % na vela cava inferior, sendo retirados fragmentos do tecido renal, para posterior imunopreciptação e "immunoblotting" com anticorpo antifosfotirosina, antilR, antiIRS-1 e antiPI3-quinase. Após infusão de insulina, três bandas ficaI:am evidentes no "immunoblotting" com anticorpo antifosfotirosina: üma banda de peso molecular de 80 kDa, que parece ser um substrato do receptor de insulina, tecido específico; outra de 95 kDa, correspondente à subunidade 13 do receptor de insulina e uma terceira, entre 165-185 kDa, coletivamente chamada pp 185 (que contém o IRS-l e IRS-2 - substratos 1 e 2 do receptor de insulina). Em experimentos para avaliação temporal e dose-resposta, verificou-se o pico de fosforilação destas proteínas aos 90 segundos após infusão, via veia cava inferior, de 10 -5 M de insulina. Nos animais mantidos em jejum prolongado houve um aumento para 189 :t 9%, p<O,OOOI (n=04) e para 134 :t 9%, p<O,OOI (n=09) nos níveis teciduais de receptor de insulina e do IRS-l respectivamente, quando comp.arados com animais alimentados. O nível de fosforilação em tirosina sofreu um aumento para 163 :t 7%, p<O,OOOI (n=05); 211:t 18%, p<O,OOOI (n=08) e para 150 :t 9%, p<O,OOOI (n=06) nas, bandas de 95 kDa (subunidade B do receptor de insulina), da pp185 e da pp 80, respectivamente. Em amostras previamente submetidas a imunoprecipitação com anticorpos antiIRS-l e, a seguir submetidas a "immunoblotting" com anticorpos antifosfotirosina, demonstrou-se um aumento para 192 :t 9%, p<0,005 (n=04) no grau de fosforilação do IRS-l. A mesma membrana de nitrocelulose incubada com anticorpo antiPI 3-quinase apresentou um aumento para 232:t 9%, p<O,OOOI (n=04) na banda correspondente a esta enzima, sugerindo que a elevação no grau de fosforilação do IRS-l é acompanhado de aumento na associação IRS-l/PI 3-quinase. Para os animais que se tornaram diabéticos após uso de estreptozotocina, houve elevação nos níveis protéicos para 186 :t 9 %, p<O,OOOI (n=8) e para 146 :t 8%, p<O,OOOI (n=8) para IR e IRS-l, respectivamente. Observou-se, também, um aumento de 141 :t 7%, p<O,OOOI (n=5) na fosforilação da subunidade f3 e para 238 :t 42% p<O,OI (n=6) da pp 185, sempre em relação ao controle. Concordante com estes resultados, a imunoprecipitação com anticorpo antiIRS-l demonstrou aumento para 230 :t 13%, p<O,OOOI (n=5) na fosforilação do IRS-l e, após imunoprecipitação com anticorpo antiPI 3-quinase, aumento na quantidade -de PI 3-quinase associada ao IRS-l para 210 :t 15%, p<O,OOOI (n=5). Aumentou, ainda, o grau de fosforilação da bandá que migra em torno da pp 120 independentemente do estímulo com insulina. Esses resultados demonstraram elevação nos níveis e grau de fosforilação do receptor de insulina e do IRS-l em tecido renal, em situações de hipoinsulinemia (jejum e diabetes mellitus), sugerindo uma regulação similar à que ocorre no tecido hepáticQ. O efeito de envelhecimento sobre as proteínas envolvidas na transmissão do sinal insulínico foi caracterizado por uma diminuição para 58 :t 12% (p<0,05) na fosforilação do receptor de insulina, para 66 :t 6% (p<0,05) na da pp 185 e para 68 :t 12% (p<0,05) na fosforilação da pp 80. Em concordância, a associação IRS-l/PI 3-quinase apresentou uma diminuição para 40 :t 15 % (p<0,05). A redução no grau de fosforilação, tanto do receptor de insulina quanto do IRS-l, não foi acompanhada de redução no nível tecidual desta proteína. No envelhecimento,aregulação das proteínas envolvidas nas etapas iniciais da transmissão do sinal insulínico em tecido renal foi também similar à do tecido hepático. Animais submetidos à nefrectomia contralateral tiveram seu tecido renal remanescente estudado no 2°, 7° e 28° dia após a cirurgia, não havendo diferença na quantidade de receptor de insulina nestes diferentes tempos. O nível protéico do IRS-1 apresentou significativa diminuição para 57:t 12%, p<0,05 (n=04) nos operados há 28 dias. O grau de fosforilação da subunidade 13 do receptor de insulina reduziu-se para 76 :t 10%, p<0,05 (n=04); 79 :t 5%, p<0,05 (n=05) e 63 :t 11%, p<0,05 (n=06), e o da pp185 para 63 :t 6%,p<0,0001 (n=08); 58 :t 6%,p<0,0001 (n=06) e 46:t 5%,p<0,0001 (n=07) nos animais nefrectomizados há 2, 7 e 28 dias respectivamente. Com relação à associação IRS-l/PI3-quinase, demonstrou-se uma redução para 50 :t 5%, p<0,0001 (n04), nos operados há 7 dias. Em conclusão, os resultados deste estudo demonstram que, em situações de hipoinsulinemia há um aumento e, durante o envelhecimento, há uma redução nos níveis e graus de fosforilação do receptor de insulina e do IRS-l e na interação deste com a P I 3-quinase, em tecido renal. Em situações de crescimento renal, há um comportamento heterogêneo no. grau de fosforilação destas proteínas, reduzindo-se no crescimento renal compensatório à uninefrectomia e aumentando no diabetes melittus

Abstract: Insulin stimulates the tyrosine kinase activity of its receptor, resulting in the phosphorylation of its cytosolic substrate IRS-l, which, in tum, associates with phosphatidylinositol 3-kinase (pI 3-Kinase). In the last few years its has been shown that the first steps of insulin action...

Abstract: Insulin stimulates the tyrosine kinase activity of its receptor, resulting in the phosphorylation of its cytosolic substrate IRS-l, which, in tum, associates with phosphatidylinositol 3-kinase (pI 3-Kinase). In the last few years its has been shown that the first steps of insulin action have a tissue-specific regulation in different physiophatologic situations. These studies have been done in muscle, liver and adipose tissue but not in kidney. In the present study we have examined the levels and phosphorylation status ofthe receptor, IRS-l, and P I 3-Kinase in kidney using four animal models: fasting, diabetes (STZ), aging and kidney hypertrophy. In the methodology used there was insulin infusion into cava vein and kidney Was removed and used for immunoprecipitation and immunob lotting with antiphosphotyrosine, anti-insulin receptor, anti IRS-l and anti PI 3-kinase antibodies.
After stimulation with insulin three broad bands appeared m. antiphosphotyrosine immunoblotting: A band of - 80 kDa ( probably tissue-specific insulin receptor substrate), a band 95 kDa (J3-subunit of insulin receptor) and a band of 165-185 kDa (it contains IRS-l and IRS-2). A time course and dose-response experiments were performed and showed that the maximal phosphorylation of IRS-l occurs between 60-90 seconds afiei 10-5 M insulin infusion. In the fasting group there was an increase to 189 :t 9% (p<O.OOOI) and to 134 :!: I 9% (p<0.001) in IR and IRS-1 protein levels, respectively. There was a simultaneous Iincrease in insulin receptor, pp 185 and pp 80 after insúlin stimulation phosphorylation, to 163 :t 7% (p<O.OOOI), 211 :t 18% (p<O.OOOI) and 150 :t 9% (p<O,OOOI) respectively determined by immunoblotting with antiphosphotyrosine antibody. In samples previously immunoprecipitated with antiIRS-l antibody and blotted with antiphosphotyrosine antibody, there was a 92 :t 8% (p<0.005) increase in phosphorylation levels, accompained by an increase to 232 :t 9% (p<O.OOOI) in insulin stimulated IRS-1 association with P I 3-kinase. In the STZ diabetes rats there was an increase of 186 :t 9% (p<0.0001) and 146 :t 8% (p<O.OOOI) in IR and IRS-l protein levels, 'respectively. There was a simultaneous increase after insulin stimulation of insulin receptor and pp 185 phosphorylation to 141 :t 7%(p<0.0001) and 238 :t 42% (p<0.01) respectively determined by immunoblotting with antiphosphotyrosine antibody. In the basal state a closely spaced doublet band with molecular mass between 110 and 120 kDa has an increase in phosphorylation status in the kidney of STZ-diabetes rats. The increase in IRS-l protein leveI in STZ diabetes rats maybe important because this protein is a substrate of number of polypeptyde growth factors. Taken together the results these data suggest that in hypoinsulinemic animal (fasting and STZ-diabetes) the regulation of IR and IRS-l in kidney is similar to tiver. There were no changes in insulin receptor and IRS-l protein levels in kidney of 2-20 months-old rats, as determinated by immunoblotting using antibody to the COOH-terminus of the receptor and to IRS-l. However, insulin stimulation of the insulin receptor, IRS-l and pp80 phosphorylation, as determined by immunoblotting with antiphosphotyrosine antibody, was 'reduced by 58 :t 12% (p<0.05), 66 :t 6% (p<O.OOOI) and 69:t 8% (p<0.005) respectively in the kidney of rats at 20 months. These data suggest that changes in the early steps of insulin signal transduction in kidney tissue are also similar to what happened in the liver tissue in aging. In remaining kidney after 2, 7 and 28 days unilateral nephrectomy, there were no changes in insulin receptor concentration. IRS-l protein levels decreased to 57 :t 12% (p<0.05) after 28 days of nephrectomy. After insulin stimulation there was a reduction in insulin receptor phosphorylation to 76 :t 10% (p<0.05), 79 :t 5% (p<0.005), 63 :tIl % (p<0.05) and of pp 185 to 63 :t 6% (p<O.OOOI), 58 :t 6% (p<O.OOOI), 46 :t 5% (p<0.0001) to 2, 7 and 28 respectively. In samples previous immunoprecipitated with anti-IRS-l antibody and blotted with antiphosphotyrosine antibody, there were 50 % decrease in the insulin-stimulated IRS-l association with PI 3-kinase after 7 days later nephrectomy. In conclusion, our results showed that in hypoinsulinemic animal there were an lDcrease in the phosphorylation levels of insulin receptor, IRS-l and IRS-l/PI 3-K association, while in the aging model there were a reduction in the phosphorylation status of these proteins in kidney. In situations of kidney growth there is a heterogenous behaviour of the phosphorylation of these proteins, increasing in STZ-diabetes and decreasing in compensatory renal hypertrophy after uninefrectomy