Orientador: Gilberto de Nucci

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Nesta tese, caracterizamos bioquímica e farmacologicamente três polipeptídeos do veneno da aranha Phoneutria nigriventer. Após o fracionamento parcial do veneno através da filtração em gel de Sephadex G-1 O e cromatografia de troca iônica, obtivemos oito frações com atividade espasmogênica...

Resumo: Nesta tese, caracterizamos bioquímica e farmacologicamente três polipeptídeos do veneno da aranha Phoneutria nigriventer. Após o fracionamento parcial do veneno através da filtração em gel de Sephadex G-1 O e cromatografia de troca iônica, obtivemos oito frações com atividade espasmogênica em tecidos arteriais e venosos de coelho e uma fração com atividade edematogênica em pele de coelho. Duas das frações com atividade sobre o músculo liso vascular foram selecionadas para purificação em HPLC e caracterização bioquímica através de eletroforese, determinação da composição de aminoácidos e seqüenciamento da região N-terminal dos polipeptídeos, denominados PNV1 e PNV2. A fração com atividade edematogênica em pele de coelho foi também purificada e o polipeptídeo responsável por esta atividade caracterizado bioquimicamente e denominado PNV3. A atividade espasmogênica do PNV1, PNV2 e das frações provenientes das várias etapas de purificação, foi testada num sistema de cascata. Os coelhos anestesiados, foram exsanguinados e os vasos sanguíneos (artéria pulmonar e veias cava e mesentérica) foram removidos, cortados em espiral e montados para registro isotônico das contrações. O PNV1, PNV2 e as frações obtidas após purificação por HPLC foram liofilizadas, ressuspendidas em H2O deionizada e injetadas na forma de "bolus" sobre os tecidos. A atividade edematogênica do PNV3 e das frações provenientes das várias etapas de purificação, foi testada em coelhos anestesiados e injetados com uma mistura de azul de Evans (0,5 ml/kg, 2,5%) e 1251-albumina (1,5 µCi/kg). As substâncias testadas foram injetadas intradermicamente no dorso dos animais. Após 30 minutos, foi coletado o sangue e o animal sacrificado. A pele dorsal foi removida e os sítios cortados para contagem de radioatividade acumulada. O PNV1, PNV2 e PNV3 possuem massa molecular de 13,9 kDa, 12,1 kDa e 14,5 kDa, com 125, 102 e 132 resíduos, respectivamente. A seqüência N-terminal para os três polipeptídeos foi a seguinte: EAFPGQST, LAKRADICQPGKTSQRACET e AVFAIQDQPC, respectivamente. A purificação e caracterização bioquímica destes peptídeos se constitui em ferramentas úteis não apenas para uma melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos decorrentes do envenenamento humano por Phoneutria nigriventer mas também para a compreensão do papel do sistema calicreína tissular-cininogênio cinina, tendo em vista que nossos resultado sugerem fortemente que o PNV3 é capaz de ativar este sistema

Abstract: This thesis describes the biochemical and pharmacological characterization of three polypeptides from the venom of the spider Phoneutria nigriventer. The fractionation of Phoneutria nigriventer venom by gel filtration on Sephadex G-10-120 provided eight peaks (SI to S-VIII) of which only...

Abstract: This thesis describes the biochemical and pharmacological characterization of three polypeptides from the venom of the spider Phoneutria nigriventer. The fractionation of Phoneutria nigriventer venom by gel filtration on Sephadex G-10-120 provided eight peaks (SI to S-VIII) of which only the first (S-I) was investigated further. lonexchange chromatography of S-I on CM-cellulose-52 yielded 16 fractions (C-I to C-XVI). Of these, Fractions C-VII + VIII and C-X +XI were further purified by reverse phase HPLC to yield two polypeptides (PNV1 and PNV2) with contractile activity. Similar purification of Fraction C-XIII by HPLC resulted in the isolation of the polypeptide with oedematogenic activity (PNV3). Ali three proteins were single chain polypeptides (as shown by SDS-PAGE under reducing conditions) with global amino acid compositions (excluding Trp) of 125, 102 and 132 residues corresponding to molecular weights of 13,900, 12,100 and 14,500 for PNV1, PNV2 and PNV3, respectively. The N-terminal amino acid sequencesof PNV1, PNV2 and PNV3 were: EAFPGQST, LAKRADICQPGKTSQRACET, and AVFAIQDQPC. The contractile activity of PNV1 and PNV2 was examined using rabbit arterial and venous vessels. The vessels were mounted in a cascade system and perfused with warm (37°C) and oxygenated (95% O2 + 5% CO2 Krebs' solution. Since the spasmogenic effect of whole Phoneutria nigriventer venom in rabbit vascular smooth muscle is not affected by tetrodotoxin, it is unlikely that sodium channel activation plays a role in these tissues, as it does in both rat phrenic-diaphragm muscle-nerve preparation and guinea-pig isolated atria. Furthermore, the finding that the a-adrenoceptor antagonist phenoxybenzamine does not affect PNV-induced contractions excludes the possibility that Phoneutria nígríventer venom induces endogenous noradrenaline release from autonomic nerve endings present in the vascular walls, as occurs in guinea pig auricles. Phoneutría envenomation is mainly characterized by severe local pain, but it may be accompanied by vascular disturbances such as lung oedema and priapism. Whether these peptides with vascular smooth muscle spasmogenic activity are responsible for the mentioned permeability alterations, it remains to be further investigated. The oedema formation induced by PNV3 was investigated in rabbit skin as the local accumulation of 1251-human serum albumin. Our results showed that PNV3 significantly increased the vascular permeability in the rabbit skin. The increased microvascular permeability induced by whole Phoneutría nígríventer venom in rabbit skin involves local kinin synthesis in response to the activation of tissue (but not plasma) kallikrein-kininogen-kinin system. The biochemical identification of the peptide responsible for this activity in Phoneutría venom might provide a useful tool to further understand the role of tissue kallikrein-kinin system