Orientador: Benedito de Oliveira Filho

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: A crotoxina, isolada e cristalizada em 1938 por Slotta e Fraenkel-Conrat a partir do veneno total de Crotalus durissus terrificus mostrou ser um complexo resultante da interação quaternária de duas sub-unidades representadas por uma proteína ácida com massa molecular de 9 kDa denominada...

Resumo: A crotoxina, isolada e cristalizada em 1938 por Slotta e Fraenkel-Conrat a partir do veneno total de Crotalus durissus terrificus mostrou ser um complexo resultante da interação quaternária de duas sub-unidades representadas por uma proteína ácida com massa molecular de 9 kDa denominada crotapotina e um componente básico, com massa molecular de 14,5 kDa que foi identificado como sendo uma fosfolipase A2 (PLA2 ). Esta última é considerada o principal componente responsável pelo desencadeamento dos efeitos farmacológicos induzidos pelo complexo crotoxina. Estudos mais recentes demonstraram a ocorrência de várias isoformas de PLA2, presentes em diferentes lotes de veneno coletados de várias serpentes, sendo tais isoformas decorrentes da expressão de diferentes RNAs mensageiros. As PLA2 (EC 3.1.1.4.) são enzimas que catalisam especificamente a reação de hidrólise da ligação acil-ester na posição sn-2 de fosfoglicerídeos numa reação dependente de álcio, liberando quantidades equimolares de ácidos graxos livres e lisofosfolipídeos. Já foi demonstrado que trações puras de PLA2 apresentam efeitos inibitórios marcantes sobre várias funções mitocondriais, reduzindo as atividades da NADH oxidase, das succinato e NADH-desidrogenase e da capacidade de fosforilação. Além disso, as PLA2 podem modificar a microviscosidade da fase lipídica da bicamada hidrofóbica de membranas, afetando a atividade funcional de enzimas ligadas à membrana, e, através desse mecanismo, regular vários processos metabólicos. No presente trabalho purificamos e caracterizamos, a partir da crotoxina, três isoformas de PLA2 (F1, F2 e F3) com elevado grau de pureza. As isoformas apresentaram massa molecular aparente com valor igual a 15 kDa e alta homologia seqüencial dos 20 resíduos N-terminais em comparação a isoformas já descritas na literatura. o efeito de cada isoforma de PLA2 purificada sobre mitocôndrias isoladas de fígado de rato foi determinado através de consumo de oxigênio durante o estado respiratório 4 e de inchamento mitocondrial. FI apresentou um estímulo dose dependente do consumo de oxigênio enquanto F2 e F3 causaram estímulo apenas em baixas concentrações e inibição em quantidades maiores. Esses efeitos foram completamente abolidos quando soro albumina bovina a 0,1% ou EGTA a 0,5mM estavam presentes no meio de incubação. Usando-se o inchamento mitocondrial como um parâmetro comparativo, todas as isoformas apresentaram o mesmo comportamento com intensidades diferentes, levando à permeabilização da membrana mitocondrial. Neste caso, a adição de EGTA preveniu o inchamento enquanto a soro albumina bovina foi ineficiente, indicando que o microambiente lipídico foi realmente afetado. Esses resultados sugerem que ácidos graxos livres liberados pela ação das isoformas são diretamente responsáveis pelos efeitos observados nos experimentos de consumo de oxigênio. A proteção oferecida pela CSA contra o inchamento causado pelas isoformas, principalmente quando estas estavam presentes em baixas concentrações, sugere que a ligação da CSA a um sítio da membrana mitocondrial protege esta última contra o ataque das PLA2. Já a pequena proteção oferecida pelo CAT, bem como o prevalecimento do pequeno efeito protetor do CAT quando utilizamos simultaneamente CSA e CAT, sugerem que a ligação do CAT ao seu sítio no carreador ADP/ATP impede a proteção conferida pela CSA

Abstract: Crotoxin, isolated and cristalized in 1938 by Slotta and Fraenkel-Conrat from Crotalus durissus terrificus venom showed to be a complex resultant from the quaternary association between two sub-units: an acidic protein with a molecular mass of 9 kDa named crotapotin and a basic component,...

Abstract: Crotoxin, isolated and cristalized in 1938 by Slotta and Fraenkel-Conrat from Crotalus durissus terrificus venom showed to be a complex resultant from the quaternary association between two sub-units: an acidic protein with a molecular mass of 9 kDa named crotapotin and a basic component, with a molecular mass of 14.5 kDa which was identified as a phospholipase A2 (PLA2). This last one is considered to be the main component responsible for the pharmacological effects induced by the crotoxin complex. Recent studies have demonstrated the existence of several PLA2 isoforms which were present in different venom batches collected from several snakes. These isoforms result from the expression of different menssager RNAs. The PLA2 (EC 3.1.1.4) are enzimes that specifically catalyse the hydrolysis of the acyl-ester bond at the sn-2 position of phosphoglycerides in a calcium dependent reaction, producing equimolar amounts of ftee fatty acids and Iysophospholipids. It has already been demonstrated that purified PLA2 fractions show marked inhibitory effects on several mitochondrial features, decreasing NADH-oxidase, succinate and NADH-dehydrogenase activities and phosphorylation capacity. It is also known that PLA2 can modify the microviscosity of the lipid phase of the hydrophobic membrane bilayer, affecting the functional activity of membrane-bound enzymes, and through this mechanism regulate various metabolic processes. In the present work, we have purified and characterized, from crotoxin, three PLA2 isoforms (F1, F2 and F3) with high degree of purity. The isoforms presented an apparent molecular mass of 15 kDa and a high degree of homology regarding the 20 N terminal aminoacid residues when compared to other isoforms already described in the literature. The effect of each purified phospholipase A2 isoform on isolated rat liver mitochondria was determined through mitochondrial swelling and Oz consumption during respiratory state 4. FI showed a dose-dependent stimulation of O2 consumption while F2 and F3 caused stimulation only at low doses and inhibition at higher amounts. These effects were completely suppressed by the presence of 0.1% bovine serum albumin or 0.5mM EGTA in the incubation medium. Taking the mitochondrial swelling as a comparative parameter, alI of them presented the same behaviour at different intensities, leading to permeabilization of the mitochondrial membrane. In this case, addition of EGTA prevented it whereas bovine serum albumin was ineffective, indicating that the lipid microenvironrnent was actualIy,affected. These results suggest that free fatty acids must be directly responsible for the observed effects induced by hospholipase A2 isoforms on oxygen consumption experiments. The protection confered by cyclosporin-A on swelling induced by the isoforms, mainly when they were present in low concentrations, suggests that cyclosporin-A binding to a mitochondrial membrane site protects the membrane against the phospholipase A2 attack. On the other hand, the smalI protection confered by CAT, as well as the prevailment of the small protective CAT effect when we used both CSA and CAT, suggest that the CAT binding to the ADP/ ATP carrier inhibits the protection confered by CSA