Orientador: Laurecir Gomes

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: Já foram descritos os componentes da matriz extracelular de diferentes cartilagens de mamíferos, mas sobre aves são encontradas poucas informações. Nosso trabalho, teve como objetivo extrair e identificar componentes da matriz extracelular de duas cartilagens articulares de frango...

Resumo: Já foram descritos os componentes da matriz extracelular de diferentes cartilagens de mamíferos, mas sobre aves são encontradas poucas informações. Nosso trabalho, teve como objetivo extrair e identificar componentes da matriz extracelular de duas cartilagens articulares de frango (tibiotarso e tarsometatarso). As cartilagens articulares foram homogeneizadas e os componentes extraídos com Gu-HCI4M. Após obtenção do extrato total foi realizada uma ultracentrifugação em gradiente de c1oreto de césio, onde foram obtidas as frações DI, D2, D3 e D4. O conteúdo protéico foi maior na fração D4, onde em tarsometatarso a extração foi mais eficiente (2,64 mg/rnl) do que em tibiotarso (1,6 mglrnl). Com relação à dosagem de ácido urônico, a concentração maior foi encontrada na fração Dl-tarsometatarso (1,52 mglrnl) em relação à Dl-tibiotarso (0,80 mg/rnl). A fração D4 foi aplicada em DEAE-Sephacel em tampão Tris-HCI 20mM pH 7,2 com uréia 7M. O material que se ligou ao DEAE foi eluído com um gradiente de O a 1,5M de NaCI no mesmo tampão. A análise destas frações em SDS-PAGE mostraram que somente em tibiotarso há um componente com 250 kDa, que na presença de 2-Me migra com 59 kDa. Após o teste de "immunoblotting" e CEC/azul de alcian foi possível mostrar que se trata do pequeno proteoglicano fibromodulim, em condições redutoras e não redutoras. Em tarsometatarso a proteina com 59 kDa se apresentou proeminente em condições redutoras. Uma proteína, apresentou uma banda polidispersa em tomo de 70 kDa e foi encontrada em ambas as regiões. Provavelmente, se trata do pequeno proteoglicano decorim. Proteínas não colagênicas com Mr de 46, 36 e 30 kDa foram observadas em ambas regiões. A fração DI foi analisada em Sepharose CL-6B. O perfil cromatográfico de tibiotarso e tarsometatarso foi muito semelhante. Ambas regiões apresentaram um único pico que eluiu logo após o volume morto, com Kav de 0,08. Pela análise em agarosepoliacrilamida nas duas regiões analisadas, pode ser visto uma única população de grandes proteoglicanos. O tipo de glicosaminoglicano presente em cada região foi analisado através de gel de agarose-propileno. O glicosaminoglicano predominante para as duas regiões foi condroitim-sulfato, embora tenha apresentado características diferentes para cada cartilagem. Este resultado foi confirmado após incubação com condroitinase ABC

Abstract: The extracellular matriz (ECM) components of different cartilages of mammals is already kwown, but little information is found for ECM of avian cartilage. The purpose of this work was to identi:fy the components of the ECM of tibiotarsal and tarsometatarsal cartilage of chicken. The...

Abstract: The extracellular matriz (ECM) components of different cartilages of mammals is already kwown, but little information is found for ECM of avian cartilage. The purpose of this work was to identi:fy the components of the ECM of tibiotarsal and tarsometatarsal cartilage of chicken. The cartilage was homogeneized in PBS and the fragments extracted with 4M Gu-HCI. The extract was submitted to ultracentrifugation in CsCI gradient, resulting in DI, D2, D3 e D4 fractions. The protein contents was greater in the D4 fraction and in tarsometatarsal extract the concentration of proteins (2,64 mglml) was larger than in tibiotarsal extract (1,6 mglml). With respect to uronic acid, we found more in Dltarsometatarsal (1,51 mg/ml) than in Dl-tibiotarsal (0,80 mg/ml). D4 fraction was dialysed, applied on DEAE-SepOOcel and eluted with 7M urea in 20mM Tris-HCI pH 7,2. Bound material was eluted with a gradient ranging from O to 1,5M NaCI in the same buffer. SDS-P AGE of DEAE fractions of tibiotarsal cartilage, showed a component with 250 kDa, which in presence of 2-Me appears to migrate as a 59 kDa protein. After immunoblotting and CEC/alcian blue, it was demonstrated to be the small proteoglycan fibromodulin in reducing and non-reducing conditions. In tarsometatarsal fractions this protein, migrating as 59 kDa, was detected only in reducing conditions. Another protein migrating as a polidisperse band around 70 kDa was detected in both cartilages. Probably it is the small proteoglycan decorin. Non-collagenous proteins with 46,36 e 30 kDa were detected in both cartilages. DI fration was analysed in Sepharose CL-6B. The cromatography profiles were similar for tibiotarsal and tarsometatarsal cartilages. Both regions showed only one peak tOOt eluted with Kav=0,08. Analysis of fractions in SDS-P AGE and agarose-polyacrilamide gel electrophoresis showed the presence oflarge proteoglycans in tibiotarsal and tarsometatarsal material. The glicosaminoglycans were analysed in agarose gel electrophoresis for each region. The predominant glicosaminoglycan was condroitin sulfate in both cartilages, but its migration in agarose gel was different for tibiotarsal and tarsometatarsal samples. This result was confirmed using chase ABC digestion