Orientadores: Antonio Carlos Boschero, Antonio Ari Gonçalves

Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia

Resumo: O presente trabalho teve como proposta caracterizar o subtipo funcional de mAChR na célula ß pancreática, bem como elucidar os mecanismos iônicos envolvidos na estimulação muscarínica. Para isto, foram utilizadas ilhotas de ratos e camundongos, isoladas por digestão enzimática ou...

Resumo: O presente trabalho teve como proposta caracterizar o subtipo funcional de mAChR na célula ß pancreática, bem como elucidar os mecanismos iônicos envolvidos na estimulação muscarínica. Para isto, foram utilizadas ilhotas de ratos e camundongos, isoladas por digestão enzimática ou microdissecção. A resposta celular frente a estimulação pelo agonista muscarínico OXO-M foi analisada sob diferentes aspectos: (1) secreção de insulina; (2) efluxo de radioisótopos (45Ca e 86Rb); (3) concentração citoplasmática de Ca2+ ([Ca2+]i); (4) atividade elétrica; e (5) expressão dos mAChRs. Os resultados mostram que OXO-M aumentou, de forma dose-dependente, a secreção de insulina por ilhotas de roedores. Na presença de alta concentração (50 µM), OXO-M induziu uma resposta bifásica da secreção, tanto na presença de 5,6 quanto de 16,7 mM de glicose. O aumento da secreção induzido pela OXO-M foi drasticamente reduzido pela retirada de Ca2+ do meio perfusor, e completamente abolido na ausência de glicose. Entretanto, na ausência de glicose mas na presença de K+ em concentração despolarizante (40 mM), OXO-M aumentou significativamente a secreção de insulina. O efeito potencializador da OXO-M foi inibido pelos antagonistas 4-DAMP (M3); p-F-HHSiD (M3>M1>M2) e pirenzepina (M1) com valores de IC50 para estes antagonistas de ~ 5, 20 e 340 nM, respectivamente. A análise molecular do subtipo de mAChR expresso nas ilhotas pancreáticas, realizada pela amplificação do cDNA por PCR, demonstrou a presença dos subtipos M1 e M3 no tecido. Entretanto, o estudo farmacológico indicou que o subtipo M3 representa o receptor muscarínico que medeia a estimulação da célula ß. Em outra série de experimentos, foram estudados os movimentos iônicos envolvidos na estimulação celular induzida pela OXO-M. Na presença de 5,6, 11,2 ou na ausência de glicose, OXO-M aumentou a [Ca2+]i de células ß isoladas. Este aumento foi parcialmente inibido pela adição de EGT A no meio de perfusão. OXO-M (50 µM) também aumentou o efluxo de 45Ca de ilhotas perfundidas, tanto na presença quanto na ausência de Ca2+ no meio extracelular. Entretanto, na ausência de Ca2+ (condição que representa o fluxo unidirecional provindo de compartimentos intracelulares), o aumento no efluxo foi transiente. A curva obtida pela diferença entre os efluxos normalizados, em ambas as condições experimentais, demonstrou a presença de um segundo componente, de aparecimento tardio e provavelmente decorrente da entrada de Ca2+ nas células. Tanto na presença quanto na ausência de glicose, OXO-M aumentou o efluxo do 86Rb. OXO-M também aumentou a atividade elétrica induzida pela glicose. Em 11,2 mM de glicose, OXO-M (0,1 e 10 µM) produziu diferentes efeitos sobre a atividade elétrica. Em ambas as concentrações, o agonista provocou o aumento na freqüência de bursts. Por outro lado, em presença de concentrações micromolares OXO-M induziu alterações multifásicas na atividade elétrica, caracterizada pela inibição transiente da atividade elétrica (i.e., polarização da membrana), seguida pelo aumento na freqüência de bursts e por uma pequena despolarização da membrana na fase silente. O efeito polarizante da OXO-M foi inibido pela ChTX, um bloqueador dos canais de K+ ativados por Ca2+ (KCa). A permeabilidade ao K+, calculada a partir dos valores de efluxo do 86Rb e de potencial de membrana, aumentou durante a fase de polarização, mas não foi diferente do controle durante o estado estacionário. Concluindo, o efeito potencializador da OXO-M sobre a secreção de insulina induzida pela glicose depende da ativação dos receptores muscarínicos do subtipo M3, presentes na membrana da célula ß. Semelhante ao observado na estimulação por outros agonistas (p.e., ACh e CCh), o aumento na secreção depende da presença de glicose e Ca2+ no meio extracelular. A polarização transiente induzida por concentrações micromolares de OXO-M representa a ativação dos canais KCa. Por outro lado, a permeabilidade ao K+ no período estacionário indica que a despolarização da membrana não é conseqüência do bloqueio de canais de K+, mas provavelmente da ativação de uma corrente sensível aos níveis intracelulares de Ca2+ (CRAC). Assim, o balanço entre a ativação dos canais KCa e CRAC poderiam determinar o grau de despolarização induzi da por agonistas muscarínicos, mecanismo este provavelmente importante na modulação da secreção de insulina durante a estimulação colinérgica

Abstract: The effects of the muscarinic agonist oxotremorine-m (OXO-M) on insulin secretion, 45Ca and 86Rb fluxes, cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i), and electrical activity in pancreatic rodent ß-cells were studied. ln the presence of glucose, OXO-M produced a dose-dependent potentiation of...

Abstract: The effects of the muscarinic agonist oxotremorine-m (OXO-M) on insulin secretion, 45Ca and 86Rb fluxes, cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i), and electrical activity in pancreatic rodent ß-cells were studied. ln the presence of glucose, OXO-M produced a dose-dependent potentiation of insulin secretion from rat and mouse islets. Higher doses of OXO-M (50 µM) induced a biphasic insulin response, both at low (5.6 mM) or high (16.7 mM) glucose concentration. ln a Ca2+-deficient medium containing glucose (5.6 mM), OXO-M evoked only a reduced first phase of insulin secretion. ln the absence of glucose, OXO-M (up to 200 µM) did not effected basal secretion. However, in the absence of glucose, but at a depolarizing K+ concentration (40 mM), OXO-M significantly increased
insulin release from incubated islets. The potentiating effects of OXO-M were inhibited by the muscarinic receptor antagonists 4-DAMP (M3), p-F-HHSiD (M3> M1>M2), and pirenzepine (M1) in a dose-dependent manner; half maximal inhibitory concentration values were ~ 5, 20, and 340 nM, respectively. cDNAs encoding for M1 and M3 muscarinic acetylcholine receptors (mAChRs) were detected in rat pancreatic islet cells by polimerase chain reaction (PCR) amplification techniques. The PCR products showed bands with the expected base pair number corresponding to M1 and M3 selected sequences. ln other series of experiments, we studied the ionic movements under muscarinic stimulation. At zero, 5.6 or 11.2 mM glucose, OXO-M increased the [Ca2+]i in isolated ß-cells. The increment in the [Ca2+]i was partially inhibited by the addition of EGTA in the perifusion medium. OXO-M (50 µM) also increased 45Ca efflux from islets perifused either in the presence or in the absence of Ca2+. However, under the latter condition, the efllux (which reflects intracellular Ca2+ mobilization) was transient. The normalized difference between emuxes revealed the presence of a delayed and sustained second component, originating from the extracellular space. Either in presence or absence of glucose, OXO-M increased 86Rb efflux. OXO-M also produced a dose-dependent increase on the glucoseinduced electrical activity. At 11.2 mM glucose, OXO-M (0.1 and 10 µM) had two distinct effects: both concentrations increased the steady-state burst frequency; however, micromolar concentrations of OXO-M induced a multiphasic change in the pattern of electrical activity, including a transient inhibition of electrical activity and then a phase of high burst frequency, which was accompanied by a small depolarization in the membrane during the silent phase. The polarizing effect of OXO-M was almost completely suppressed by charibdotoxin (ChTX), a blocker of the large conductance [Ca2+ ]i ¿ activated potassium channel (KCa). K+-permeability values, calculated from 86Rb efflux and electrical measurements, increased during the polarizing phase, but was not different from control values (no OXO-M) during the steady state period. In conclusion, the potentiation of glucose-induced insulin secretion by OXO-M depends on the activation of a muscarinic M3 receptor subtype, present in the ß-cell plasma membrane. As already observed for others muscarinic agonists, such as ACh and CCh, OXO-M potentiated-insulin secretion depends on the presence of suitable amount of glucose and Ca2+ in the extracellular medium. The rapid and transient polarization induced by OXO-M (over 1 µM) represents the activation of the maxi K+-channel. As OXO-M did not changed K+ permeability during the steady-state period, the depolarizing effect of OXO-M does not reflects a decrease in K+-permeability. Instead, it may be the consequence of activation of a current sensitive to the depletion of intracellular Ca2+ stores (CRAC). Thus, the balance between the activation of KCa channel and CRAC could dictate the degree of depolarization induced by muscarinic agonists. Finally, although the KCa channel was not implicated in the repolarization of glucose-induced electrical activity in ß-cells, our results support the idea that the maxi K+-channel could play a role in the cholinergic modulation of insulin secretion