Orientador: Laurecir Gomes

Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Biologia

Resumo: Este trabalho teve por objetivo analisar os componentes da MEC da cartilagem articular bovina de diferentes regiões do joelho (FI, F2, F3, P e T) que suportam forças biomecânicas de diferentes intensidades. A análise das fendas artificiais demonstrou que as regiões apresentaram diferentes...

Resumo: Este trabalho teve por objetivo analisar os componentes da MEC da cartilagem articular bovina de diferentes regiões do joelho (FI, F2, F3, P e T) que suportam forças biomecânicas de diferentes intensidades. A análise das fendas artificiais demonstrou que as regiões apresentaram diferentes padrões para o direcionamento das fibras colagênicas na camada superficial da cartilagem. Apesar disso o conteúdo relativo de colágeno não apresentou diferença significativa. As extrações realizadas com Gu-HCI 4M solubilizaram conteúdos de proteínas e ácido urônico semelhantes em todas as regiões. A quantificação total de GAGs apresentou valores significativamente diferentes. F2, F3 e FI apresentaram os maiores valores e P e T os menores. Os extratos foram submetidos a ultracentrifugação com CsCI e obtidas quatro trações (DI, D2, D3 e D4). A quantificação de proteínas, mais abundante em D4, mostrou diferença significativa entre as regiões. F3, P e FI apresentaram os maiores valores e F2 e T, os menores. A quantificação de ácido urônico, mais abundante em DI, não apresentou diferença significativa. Para análise qualitativa dos PGs na fração DI utilizou-se cromatografia de gel filtração. Três populações de PGs foram isoladas. Os padrões de migração para moléculas de alto peso foram avaliados em gel de agarose-poliacrilamida e as de menor peso em SDS-PAGE. Entre os PGs detectados em SDS-PAGE, P foi a região com maior conteúdo e FI apresentou, somente a população de maior peso. Te F3 apresentaram o padrão de migração mais rápido e polidisperso e P, F2 e FI apresentaram padrões mais lentos. A dimensão dos GAGs dos PGs foram avaliados, em gel de poliacrilarnida com tampão barbital, após digestão com papaína. Duas populações de cadeias de GAGs foram encontradas ( 40 kDa e acima de 150 kDa). O emprego de Chase AC e posterior análise em gel de agarose-poliacrilarnida indicou a presença de CS como único GAG.
Para análise qualitativa das populações de proteínas não-colagênicas, em D4, utilizou-se cromatografia de troca iônica com gradiente de NaCI (O - 1,5 M). Em todas as regiões não foi observado material catiôQÍco. O material foi eluído com a concentração de
NaCI entre O - 0,6 M e as proteínas analisadas em SDS-P AGE. O Mr das moléculas observadas variou de 190 a 19 kDa e foi detectado fibromodulim em todas as regiões através da coloração CEC-azul de alcian e "immunoblotting". O fibromodulim (60 - 67 kDa) apresentou um comportamento de autoagregação, mais evidente em T e FI

Abstract:The purpose of this work was to analyse cartilage ECM components of five differents regions of knee joint (FI, F2, F3, P and T). These regions withstand different intensities ofbiomechanical forces. The analyses of artificial slits showed differents standars of collagen fibers directions on...

Abstract:The purpose of this work was to analyse cartilage ECM components of five differents regions of knee joint (FI, F2, F3, P and T). These regions withstand different intensities ofbiomechanical forces. The analyses of artificial slits showed differents standars of collagen fibers directions on cartilage superficiallayer. Despite this, the relative content of collagen did not show significant difference.
The content of proteins and uronic acid were similar for each region. The total content of GAG showed significant differents values. F2, F3 and FI showed higher and P and T lower values. The extracts were submitted to ultracentrifugation in CsCI gradient, resulting in DI, D2, D3 and D4 ftactions. Proteins were concentrated in D4 fractions. Considering the different regions, more proteins were detected in D4 fractions of F3, P and FI regions, and less in F2 and T. Uronic acid values did not prove significant diference. DI was fractioned through gel filtration chromatography. The analyses offtactions was by agarose-polyacrylamide gel electrophoresis and SDS-P AGE, showing the presence of three . populations of PGs. In SDS-P AGE, two polydisperse bands were detected, probably related to the smali proteoglycans decorin and biglican. These molecules were prominent in P region. In FI region only that one with higher Mr was observed. In, agarose-polyacrylamide, T and F3 showed faster and more polydisperse bands, than P, F2 and FI regions. Considering these last regions, P exhibited a slower band, F2 a, intermediate and FI a faster one. The Mr of GAGs were estimated in P AGE with barbital buffer after papain digestion. Two populations of GAGs were found (~ 40 IeDa and another one larger than 150 kDa). Digestion with chondroitinase AC and analyses by agarose-polyacrilamide gel electrophoresis indicated that CS was the only GAG
component present. Non-collagenous proteins present in D4 ftaction were analysed in ion exchange chromatography with NaCI gradient (O - 1.5 M) and SDS-PAGE. For all regions, no material was eluted before the begining of the gradient. The material was eluted with NaCl concentration between O - 0.6 M. The Mr of molecules observed in SDS-PAGE was among 190 - 19 kDa. A polydisperse band (60 - 67 kDa) was detected in all regions. Analyses with CEC-alcian blue and immunoblotting methods, indicated that protein as being fibromodulim. This small proteoglycan showed self-aggregation behaviour, specially in samples from T and FI regions