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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Adaptive laboratory evolution of C. saccharoperbutylacetonicum for enhanced tolerance towards lignocellulosic inhibitors in butanol production : Evolução adaptativa em laboratório da linhagem C. saccharoperbutylacetonicum para aumento da tolerância aos inibidores lignocelulósicos para produção de butanol
Title Alternative: Evolução adaptativa em laboratório da linhagem C. saccharoperbutylacetonicum para aumento da tolerância aos inibidores lignocelulósicos para produção de butanol
Author: Alves, Rafael Ferraz
Advisor: Azzoni, Sindelia Freitas
Abstract: Resumo: A produção de produtos de segunda geração (2G) inclui o butanol, que é uma molécula com um grande espectro de aplicações industriais, incluindo o uso como biocombustível. O butanol tem sido tradicionalmente produzido por rota química ou através de fermentação anaeróbica utilizando bactérias solventogênicas do gênero Clostridium spp. Estas bactérias são capazes de metabolizar grande variedade de fontes de carbono, incluindo a xilose o principal açúcar presente no hidrolisado hemicelulósico (HH). Entretanto a fermentação deste hidrolisado é severamente impactada pela presença de compostos inibitórios que afetam o crescimento dos microrganismos e a síntese de produtos de interesse. Assim, o objetivo deste trabalho foi gerar linhagens mutantes de Clostridium spp capazes de tolerar os principais inibidores presentes no hidrolisado hemicelulósico através de estratégias de evolução adaptativa (ALE). Os resultados obtidos mostraram que entre as linhagens estudadas inicialmente (C. acetobutylicum, C. beijerinkii, C. saccharobutylicum and C. saccharoperbutylacetonicum), o C. saccharoperbutylacetonicum apresentou o melhor desempenho fermentativo nas concentrações estudadas de açúcar inicial (10 g/L até 60 g/L), de modo que 50 g/L foi a condição que permitiu a máxima concentração de butanol (14.5 g/L) e rendimento de butanol (0.29 g/g). Além disso, a avaliação de quatorze inibidores no crescimento do C. saccharoperbutylacetonicum confirmou que o ácido acético (AA) e o 5-hydroxymethylfurfural (HMF) foram os principais inibidores que impactaram negativamente o crescimento, sendo o AA o principal inibidor a ser monitorado. A evolução adaptativa em laboratório (ALE) foi conduzida em concentrações crescentes de hidrolisado hemicelulósico e resultou em uma população evoluída (EP-40) após aproximadamente 130 gerações, na qual quatro linhagens (RAC-2, RAC-8, RAC-21 a RAC-25) foram isoladas. Estas linhagens evoluídas foram capazes de crescer na presença de ácido acético (5 g/L) e HMF (0.4 g/L), condição esta que inibiu completamente o crescimento da linhagem parental. Comparando as quatro linhagens evoluídas obtidas, a RAC-25 apresentou o melhor desempenho fermentativo, alcançando 16.7 g/L e 0.32 g/g de concentração de butanol e rendimento, respectivamente. A análise do genoma das linhagens evoluídas mostrou que somente a RAC-25 apresentou uma mutação deletéria no gene repressor transcricional da arabinose (araR), que pode estar diretamente relacionado a melhora na eficiência do consumo de açúcar (xilose) observado nos experimentos de crescimento em meio contendo acido acético e HMF. Ademais, a mutação no anti-sigma fator I promoveu uma baixa expressão do sigI similar aos resultados obtidos com os outros mutantes. Os mutantes RAC-2, RAC-8 e RAC-21 não foram capazes de consumir eficientemente os açúcares presente nos meios (com e sem inibidores) devido á mutação no sistema PTS como uma possível estratégia para melhorar o consumo de acetato. A análise da expressão gênica indicou a expressão de genes relacionados à bomba de prótons, biossíntese de prolina e chaperoninas, sugerindo um mecanismo integrado provavelmente coordenado pela repressão do sigI para tolerância aos inibidores. Em resumo, nós descobrimos um grupo de adaptações genéticas nos microrganismos para permitir o crescimento em meios contendo altas concentrações de AA e HMF. Estes resultados são importantes, pois trazem informações relevantes sobre genes relacionados a mecanismos de tolerância em bactérias do gênero Clostridium spp.

Abstract: Production of second-generation (2G) products includes butanol, which is a molecule with a broad range of applications, including use as a biofuel. Butanol has traditionally been produced by chemical synthesis or anaerobic fermentation using solventogenic Clostridium spp. These solventogenic bacteria are able to metabolize a wide range of carbon sources, including xylose; the main sugar in the hemicellulosic hydrolysate (HH). However, the fermentation of HH is severely limited due to the presence of inhibitory compounds that affect microbial growth and product synthesis. Therefore, the aim of this work is to generate mutant strains of Clostridium spp., able to tolerate the main inhibitors present in hemicellulosic hydrolysate, via adaptive laboratory evolution (ALE). The results obtained indicated that among the strains studied (C. acetobutylicum, C. beijerinkii, C. saccharobutylicum and C. saccharoperbutylacetonicum), C. saccharoperbutylacetonicum showed the best fermentative performance in a range of initial concentrations of 10 g/L to 60 g/L; with 50 g/L being the condition with the highest butanol titer (14.5 g/L) and yield (0.29 g/g). The adaptive laboratory evolution was performed in increasing concentrations of HH and resulted in an evolved population after around 130 generations; from which four strains (RAC-2, RAC-8, RAC-21 and RAC-25) were isolated. These evolved strains were able to grow in the presence of acetic acid (5 g/L) and HMF (0.04 g/L), a condition that completely abolished the growth of the wild type strain. In previous studies, we evaluated the effect of fourteen inhibitor compounds on C. saccharoperbutylacetonicum (parental strain) growth and confirmed that acetic acid (AA) and HMF negatively impacted growth; with AA being the most relevant inhibitor to be monitored. Comparing the four evolved strains, RAC-25 presented the best fermentative performance achieving 16.7 g/L and 0.32 g/g of butanol titer and butanol yield, respectively. Genome analysis of the evolved strains revealed that only the RAC-25 strain presented a deleterious mutation in the arabinose transcriptional repressor gene (araR); which could be related to the increased sugar consumption efficiency observed in the growth experiments. Moreover, the mutation in anti-sigma factor I promoted a down regulation of sigI, similar to other evolved mutants. The mutants RAC-2, RAC-8 and RAC-21 were not able to efficiently consume sugars present in the media (both with and without inhibitors) due to a mutation in the PTS system, as a possible strategy to improve acetate consumption. The gene expression analysis indicated high expression of genes related to H+ proton pumps (ATP synthases), proline biosynthesis (gamma phosphate reductase) and chaperonins (Grol); suggesting an integrated mechanism probably coordinated by the repression of sigI in order to tolerate the inhibitors. We have discovered a set of genetic adaptations in bacteria to be able to grow on a culture medium containing a high concentration of AA and HMF. Our results are important in advancing information about possible genes related to tolerance mechanisms. We conclude that sigI and araR genes may be interesting targets to obtain robust strains with high tolerance to inhibitors presented in lignocellulosic hydrolysates.
Subject: Butanol
Inibidores lignocelulósicos
Tolerância
Evolução adaptativa em laboratório
Clostridium
Language: Multilíngua
Editor: [s.n.]
Citation: ALVES, Rafael Ferraz. Adaptive laboratory evolution of C. saccharoperbutylacetonicum for enhanced tolerance towards lignocellulosic inhibitors in butanol production : Evolução adaptativa em laboratório da linhagem C. saccharoperbutylacetonicum para aumento da tolerância aos inibidores lignocelulósicos para produção de butanol . 2020. 1 recurso online ( 100 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, SP.
Date Issue: 2020
Appears in Collections:FEA - Tese e Dissertação

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