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Type: TESE
Degree Level: Doutorado
Title: Síntese de galacto-oligossacarídeos a partir de células permeabilizadas de Kluyveromyces marxianus
Title Alternative: Galactooligosaccharides synthesis with permeabilized cells of Kluyveromyces marxianus
Author: Manera, Ana Paula
Advisor: Maugeri Filho, Francisco, 1952-
Filho, Francisco Maugeri
Abstract: Resumo: Galacto-oligossacarídeos (GOS) são carboidratos não digeríveis por humanos, produzidos a partir da lactose por ação da enzima ?-galactosidase. São considerados ingredientes prebióticos e possuem propriedades favoráveis à saúde dos consumidores. Este trabalho teve como objetivo o estudo da produção de GOS a partir de células permeabilizadas de Kluyveromyces marxianus CCT 7082. A primeira etapa foi a otimização das condições de cultivo da levedura para a produção da enzima ?-galactosidase empregando como substratos os subprodutos agroindustriais, soro de queijo e água de maceração de milho, obtendo 1400 U/gcel em 24 h de fermentação. Em seguida estudou-se a permeabilização das células da levedura. Foram testados sete agentes permeabilizantes: etanol, isopropanol, butanol, acetona, brometo de cetiltrimetilamônio, Tween 80 e Triton X-100, tendo sido selecionado o isopropanol, para a etapa de otimização do processo de permeabilização, onde se avaliou o efeito da relação biomassa/isopropanol e da temperatura. Na caracterização da enzima, a ß-galactosidase das células permeabilizadas apresentou pH ótimo de 6,6 e temperatura ótima de 50°C, sendo esta mais estável no pH 7,0 e na temperatura de 30ºC. A energia de desnaturação foi 81,6 Kcal/mol. A cinética enzimática da enzima seguiu o modelo de Michaelis-Menten. O estudo da síntese de GOS, através de delineamentos experimentais, empregando as células permeabilizadas, resultou em 83 g/L de GOS. O emprego de fluidos pressurizados como meio reacional de reações enzimáticas podem favorecer a solubilidade dos compostos, as transferências de massa das reações, e aumentar a atividade e estabilidade de enzimas, assim sendo, estudou-se o comportamento da atividade enzimática da enzima das células permeabilizadas tratadas nessas condições. Foi realizado um delineamento composto central para cada fluido (n-butano, propano, CO2), sendo observado um aumento na atividade residual, em todos os ensaios dos delineamentos, de 110 a 211% dependendo do fluido. O tratamento com n-butano resultou na maior estabilidade da enzima: após 3 semanas de armazenamento a 10°C a enzima tratada manteve 96% de sua atividade. Estas células tratadas a alta pressão foram aplicadas na síntese de GOS em reator batelada a pressão atmosférica. Obteve-se aproximadamente 75 g/L de GOS para os três fluidos pressurizados e para as células permeabilizadas sem tratamento. Porém, a quantidade necessária de enzima (em gramas de células) para se obter a mesma atividade enzimática, foi bem menor para as enzimas tratadas a alta pressão, tendo em vista o aumento da atividade enzimática após o tratamento. Na etapa seguinte, estudou-se a síntese de GOS em reator batelada empregando como meio reacional fluidos pressurizados (n-butano, propano, CO2). Realizou-se um delineamento composto central para cada fluido, obtendo-se entre 65 e 83,4 g/L de GOS, dependendo do meio reacional. De acordo com os resultados deste trabalho, usando células de K. marxianus CCT 7082, pôde-se definir a metodologia empregando as células permeabilizadas, tratadas a alta pressão com n-butano e síntese em reator batelada a pressão atmosférica como a mais promissora para a produção de GOS

Abstract: Galactooligosaccharides (GOS) are humans non-digestible carbohydrates, produced from lactose by the action of the enzyme ?-galactosidase. They are considered prebiotic ingredients and have beneficial properties to the health of consumers. This work aimed the study of galacto-oligosaccharide production from permeabilized cells of Kluyveromyces marxianus CCT 7082. The first step was to optimize the yeast culture conditions in order to produce the ?-galactosidase enzyme, employing as substrates by-products from agriculture industries, such as cheese whey and corn steep liquor, it were obtained 1400 U/g in 24 h of fermentation. The next step was to study the yeast cell permeabilization. Seven permeabilizant agents were tested: ethanol, isopropanol, butanol, acetone, cetyl-trimethylammonium bromide, Tween 80 and Triton X-100. Isopropanol was selected for the optimization step of the permeabilization process, where the effect of the biomass/isopropanol ratio and the temperature on cell permeabilization were evaluated. Afterward, the ?-galactosidase from permeabilized cells was characterized presenting the optimum pH of 6.6 and the optimum temperature 50°C. The enzyme was more stable at pH 7.0 and 30°C temperature. The denaturation energy was 81.6 Kcal/mol. The enzyme kinetics followed Michaelis-Menten model. The GOS synthesis, studied through experimental designs, employing the permeabilized cells, resulted in 83 g/L of GOS. The use of pressurized fluids as a reactional medium for enzymatic reactions can help the components solubility and the mass transferences of the reactions and to increase the enzymes activity and stability. Therefore, the behavior of the enzymatic activity of the permebialized cell enzymes, treated with pressurized fluids, was studied. A central composite design was performed for each pressurized fluid, and it was observed an increase on residual activity for all pressurized fluids, in all designs essays, from 110 a 211%, depending on the fluid. The enzyme treated with n-butane resulted in the highest enzyme stability. After 3 weeks of storage at 10°C the enzyme kept 96% of activity. These cells treated at pressure were employed at GOS synthesis in batch reactor at atmospheric pressure. Around 75 g/L of GOS were obtained for all three pressurized fluids, as well as for the enzyme without treatment. However, the amount of the enzyme needed (in g of cells) to obtain the same enzymatic activity was lower in the case of the enzymes treated at high pressure, due to the increase of enzymatic activity after the treatment. In the next step of the work, the GOS synthesis was studied in batch mode, using as a reactional medium pressurized fluids (n-butane, propane, CO2). A central composite design for each pressurized fluid was carried out, obtaining between 65 g/L and 83 g/L of GOS, depending on reactional medium. According to the results of this work, using cells of K. marxianus CCT 7082, it can be defined that the methodology of permeabilized cells, treated at high pressure with n-butane and synthesis in atmospheric pressure reactor, is the most promising one for GOS production
Subject: Galactooligossacarideos
Beta-galactosidase
Permeabilização celular
Fluidos pressurizados
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: MANERA, Ana Paula. Síntese de galacto-oligossacarídeos a partir de células permeabilizadas de Kluyveromyces marxianus. 2010. 174 p. Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/256568>. Acesso em: 16 ago. 2018.
Date Issue: 2010
Appears in Collections:FEA - Tese e Dissertação

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