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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Avaliação da cariogenicidade e metabolismo de Streptococcus mutans após jejum prolongado de carboidratos : Evaluation of cariogenicity and metabolism of Streptococcus mutans after extended carbohydrate starvation
Title Alternative: Evaluation of cariogenicity and metabolism of Streptococcus mutans after extended carbohydrate starvation
Author: Oliveira, Bárbara Emanoele Costa, 1989-
Advisor: Ricomini Filho, Antônio Pedro, 1983-
Abstract: Resumo: O papel da sacarose no desenvolvimento do biofilme cariogênico tem sido amplamente estudado. No entanto, a cariogenicidade do biofilme e o metabolismo de Streptococcus mutans após jejum de sacarose ainda é desconhecido. Assim, o objetivo do primeiro capítulo foi avaliar o efeito da interrupção da exposição à sacarose na composição e metabolismo do biofilme, e na desmineralização do esmalte. Biofilmes de S. mutans UA159 (n=10/grupo) foram cultivados sobre blocos de esmalte bovino (4x7x1 mm) em meio triptona e extrato de levedura (TE) ultrafiltrado (pH 7,0; 37ºC; 10%CO2). Durante 48 h (baseline), os biofilmes foram tratados 8x/dia com glicose 5,25% + frutose 5,25% (controle: ausência de polissacarídeos extracelulares - PEC) ou sacarose 10%. A exposição aos carboidratos foi interrompida nas 48 h seguintes e amostras foram coletados no baseline, e após 24 e 48 h de jejum. As variáveis-resposta foram o pH do meio de cultura, quantificação de PEC solúveis (PEC-S) e insolúveis (PEC-I), polissacarídeos intracelulares (PIC), contagem de células viáveis (UFC), peso seco do biofilme e porcentagem de perda de dureza do esmalte (%PDS). Nível de significância ?=5% foi utilizado nas análises. Biofilmes cultivados com sacarose causaram maiores quedas de pH (p<,0001) e valores de PEC-S, PEC-I, PIC, peso seco, e %PDS significativamente maiores que o controle (p<,05). Somente PIC aumentaram significativamente após interrupção da sacarose (p<,05). A contagem de UFC não alterou no jejum, mas foram encontradas correlações significativas (p<,05) entre PIC e PEC-S (r=-0,4), e PIC e peso seco (r=0,71). No segundo capítulo objetivou-se avaliar o efeito da via de utilização da sacarose na fisiologia de S. mutans durante o jejum. Culturas de S. mutans UA159 (WT), MMZ952 (ausência de transferases), e ?ccpA foram subcultivadas (1:10) em meio TE contendo glicose 0,5% + frutose 0,5% ou sacarose 1% (pH 7,0; 37 ºC; 5%CO2). Após atingir O.D600=0.5 (baseline), as células foram coletadas, lavadas e ressuspendidas em TE fresco sem carboidratos. No baseline, e após 4 e 24 h de jejum, qRT-PCR, PIC, UFC, pH, concentrações de H+, glicose-1-fosfato (G1P), e atividade do PTS foram avaliados. Fusões PglgB::cat foram construídas para avaliar a atividade do promotor do gene glgB. Células foram visualizados por microscopia eletrônica de transmissão. Os experimentos foram realizados em triplicata e analisados a um nível de significância ?=5%. Houve ativação do operon glg durante o jejum (p<,05) em todas as cepas, mas sua expressão foi tardia (após 24 h) e significativamente menor quando PEC foram sintetizados (p<,05). Maior atividade do promotor glgB e maiores concentrações de H+ e G1P foram observadas no grupo sacarose (p<,05). PIC foram degradados linearmente no jejum apenas na cepa ?ccpA, que também apresentou maior atividade do PTS. Entretanto, somente WT exposto à sacarose foi capaz de sintetizar PIC no jejum. Portanto, sugere-se que a composição e cariogenicidade do biofilme não são alteradas após interrupção da sacarose, mas PIC continuam sendo acumulados. Adicionalmente, PEC sintetizados a partir da sacarose afetaram a capacidade de S. mutans em sintetizar e degradar PIC, sem necessariamente induzir maior expressão gênica, mas atrasando a expressão do operon glg

Abstract: The role of sucrose on cariogenic biofilm development has been widely studied. However, the biofilm cariogenicity and the Streptococcus mutans metabolism after sucrose starvation is still unknown. Thus, the aim of the first chapter was to evaluate the effect of sucrose exposure interruption on biofilm composition and metabolism, and on enamel demineralization. S. mutans UA159 biofilms (n=10/group) were grown on bovine enamel slabs (4x7x1 mm) in ultrafiltered tryptone and yeast extract (TY) medium (pH 7.0; 37ºC; 10%CO2). For 48 h (baseline), biofilms were treated 8x/day with 5.25% glucose + 5.25% fructose (control - absence of extracellular polysaccharides - EPS) or 10% sucrose. The carbohydrate exposure was interrupted for the following 48 h and samples were collected at baseline, and after 24 and 48 h of starvation. The response variables were the pH of the culture medium, quantification of soluble (S-EPS) and insoluble (I-EPS) EPS, intracellular polysaccharides (IPS), viable cells (CFU), biofilm dry weight and percentage of surface hardness loss (%SHL). A significance level of ?=5% was applied in the analyses. Biofilms cultured with sucrose caused greater pH drop (p<.0001), and values of S-EPS, I-EPS, IPS, biofilm dry weight, and %SHL (p<.05) significantly higher than the control group. Only IPS significantly increased after sucrose interruption (p<.05). CFU enumeration did not change during starvation, but significant correlations (p<.05) were found between IPS and EPS (r=-0.4), and IPS and biofilm dry weight (r=0.71). In the second chapter, the aim was to evaluate the effect of the route of sucrose utilization on S. mutans physiology during starvation. Cultures of S. mutans UA159 (WT), MMZ952 (absence of transferases), and ?ccpA were subcultured (1:10) into TY medium containing 0.5% glucose + 0.5% fructose or 1% sucrose (pH 7.0; 37 ºC; 5%CO2). After reaching O.D600=0.5 (baseline), the cells were collected, washed, and resuspended in fresh TY without carbohydrates. At baseline, and after 4 and 24 h of starvation, qRT-PCR, IPS, CFU, pH, H+ and glucose-1-phosphate (G1P) concentrations, and PTS activity were evaluated. PglgB::cat fusions were engineered to evaluate the activity of the glgB promoter. Cells were visualized by transmission electron microscopy. The experiments were carried out in triplicate and analyzed at a significance level of ?=5%. Activation of the glg operon has occurred during starvation (p<.05) in all strains, but its expression was late (after 24 h) and significantly lower when EPS were synthesized (p<.05). Greater activity of the glgB promoter and higher H+ and G1P concentrations were observed in the sucrose group (p<.05). IPS were linearly degraded during fasting only in the ?ccpA strain, which also showed higher PTS activity. However, only WT exposed to sucrose was able to synthesize IPS during starvation. Therefore, it is suggested that the biofilm composition and cariogenicity do not change after sucrose interruption, but IPS is still accumulated. In addition, EPS synthesized from sucrose affected the ability of S. mutans in synthesizing and degrading IPS, without necessarily inducing greater gene expression, but delaying the expression of the glg operon
Subject: Biofilmes
Sacarose
Carboidratos
Polissacarídeos
Cárie dentária
Language: Inglês
Editor: [s.n.]
Citation: OLIVEIRA, Bárbara Emanoele Costa. Avaliação da cariogenicidade e metabolismo de Streptococcus mutans após jejum prolongado de carboidratos: Evaluation of cariogenicity and metabolism of Streptococcus mutans after extended carbohydrate starvation. 2020. 1 recurso online (94 p.) Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba, Piracicaba, SP.
Date Issue: 2020
Appears in Collections:FOP - Tese e Dissertação

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