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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Uma nova metodologia para ligação cruzada entre resíduos de aminoácidos nucleofílicos
Title Alternative: A novel methodology for cross-linking targeting nucleophilic aminoacid residues
Author: Amaral, Bruno César do, 1991
Advisor: Gozzo, Fábio Cesar, 1972-
Abstract: Resumo: A técnica de ligação cruzada associada à espectrometria de massas (XL-MS) vem sendo utilizada com sucesso na resolução de estruturas de complexos proteicos. O método consiste na união covalente de dois ou mais resíduos reativos e espacialmente próximos da proteína através de um agente de ligação cruzada (ALC), que é uma molécula orgânica contendo dois ou mais grupos funcionais conectados por uma cadeia espaçadora. Os grupos funcionais são reativos frente às cadeias laterais de alguns resíduos da proteína, e se esse peptídeo modificado puder ser identificado, pode ser inferida uma restrição de distância entre os resíduos, indicando que, na estrutura terciária ou quaternária, a proximidade dos resíduos que reagiram é de no máximo o comprimento da cadeia espaçadora do ALC. Essa informação é valiosa para guiar uma modelagem computacional na obtenção de um modelo ou um conjunto de modelos que representem a estrutura da proteína em solução. Os ALC mais comuns utilizados em XL-MS são ésteres derivados de N-hidroxisuccinimida (NHS), em particular o DSS (suberato de dissuccinimidila), que é reativo frente a resíduos nucleofílicos, isto é, lisinas e, em menor escala, serinas. O uso de DSS possui uma série de limitações, que vão desde sua baixa solubilidade em solução aquosa até sua alta taxa de hidrólise e ao baixo rendimento da reação em baixas temperaturas. Para contornar essas limitações, foi desenvolvida uma nova química de ligação cruzada reativa também frente a resíduos nucleofílicos, utilizando o ácido adípico como ALC. Essa nova química, apresenta uma taxa de incorporação de moléculas de ácido adípico por proteína maior que a do DSS, mesmo contendo uma cadeia espaçadora menor. Além disso, a metodologia continua bastante reativa em baixas temperaturas, mantendo aproximadamente a mesma taxa de incorporação a 5, 15 e 25 ºC, ao contrário da reatividade praticamente nula do DSS a 5 e 15 ºC. Esses resultados mostram que a química desenvolvida traz diversas vantagens sobre a química de derivados de NHS, expandindo o uso da técnica de ligação cruzada para estruturas de proteínas e complexos em temperaturas muito mais baixas e, portanto, para proteínas que não são estáveis a temperatura ambiente

Abstract: Chemical cross-linking coupled to mass spectrometry (XL-MS) has been successfully used to solve the structure of proteins complexes. The method consists in covalently linking two or more reactive and spatially close residues of the protein by a cross-linker, which is an organic molecule that has two or more functional groups connected by a spacer arm. The functional groups are able to react with the side chains of some of the protein¿s residues, and if the cross-linked peptide can be identified a distance can be inferred between the residues, indicating that in the tertiary (or quaternary) structure, both residues are spatially close within the reach of the spacer arm. This information is valuable to guide a computational modelling to obtain a model or a set of models that represents the structure of that protein in solution. The most common cross-linkers used in XL-MS are esters derived of N-hidroxysuccinimide, in particular DSS (disuccinimidyl suberate) which are reactive against nucleophilic residues, i.e. lysine and, in smaller scale, serine. The use of DSS has many limitations, which goes from its low solubility in aqueous medium to its tendency to hydrolysis and the reaction¿s low yield in lower temperatures. To circumvent these limitations, we developed a new cross-linking chemistry targeting nucleophilic residues, where adipic acid act as a cross-linker. This chemistry presents a higher incorporation rate than DSS, i.e. it incorporates more cross-linker molecules per protein than DSS, even having a smaller spacer arm. Moreover, this methodology is still very reactive at low temperatures, keeping approximately the same incorporation rate at 5, 15 and 25 ºC, in contrast to the practically nonexistent reactivity of DSS reaction at 5 and 15 ºC. These results show that this new cross-linking chemistry presents several advantages over NHS based cross-linkers, expanding its applications to structures of proteins and complexes in very low temperatures and, therefore, to proteins that are not stable at room temperatures
Subject: Espectrometria de massas
Ligação cruzada
Proteômica estrutural
Proteínas
Proteinas - Estrutura
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: AMARAL, Bruno César do. Uma nova metodologia para ligação cruzada entre resíduos de aminoácidos nucleofílicos. 2017. 1 recurso online (80 p.). Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Química, Campinas, SP.
Date Issue: 2017
Appears in Collections:IQ - Tese e Dissertação

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