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Type: DISSERTAÇÃO DIGITAL
Degree Level: Mestrado
Title: Estudo de caracterização funcional da proteína SH2D4A humana
Title Alternative: Functional characterization study of human SH2D4A protein
Author: Tamborlin, Letícia, 1993-
Advisor: Luchessi, Augusto Ducati, 1976-
Abstract: Resumo: Introdução: O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) está envolvido com a iniciação e elongação da tradução e apresenta relação com os processos de transcrição, trânsito de macromoléculas pelo complexo do poro nuclear, decaimento de mRNAs, proliferação e diferenciação celular, além de, também estar relacionado com processos inflamatórios, diabetes, câncer, malária e infecções virais, tais como HIV-1 e EBOV. O eIF5A é produzido pelas células como precursor inativo e a hipusinação deste fator é uma modificação pós-traducional essencial para sua atividade e para a viabilidade celular. Ensaios de espectrometria de massas revelaram a proteína SH2D4A como possível parceiro de interação a eIF5A-FLAG purificada a partir de extratos de células de adenocarcinoma de colo de útero humano (HeLa). Nestes ensaios, constatou-se que um peptídeo derivado da proteína SH2D4A poderia estar hipusinado, fato intrigante, pois desde a descoberta da hipusinação do eIF5A na década de 70 não há evidências da existência de qualquer outra proteína hipusinada. Já a proteína SH2D4A tem o seu gene localizado no cromossomo 8p, próximo a alguns genes associados à supressão tumoral. Esta região encontra-se deletada em pacientes com hepatocarcinoma celular (HCC) que não apresentam boas respostas aos tratamentos, sugerindo que a depleção de SH2D4A pode estar envolvida com a progressão do tumor. Recentemente, foi demonstrado que SH2D4A interage e inibe a atividade do fator de transcrição STAT3 controlado pela via de sinalização de interleucina 6 (IL-6), inibindo a transcrição de genes envolvidos com a proliferação celular, sobrevivência e desenvolvimento de tumores. Entretanto, apesar de fortes evidências relacionando SH2D4A com o desenvolvimeno de tumores, existem menos de 15 estudos publicados envolvendo essa proteína. Justificativa: Atualmente, não são conhecidas vias de biossíntese de hipusina não associadas ao processo de modificação pós-traducional de eIF5A e, também, a existência de outras proteínas hipusinadas. Deste modo, indícios de que a proteína SH2D4A pudesse apresentar o resíduo de aminoácido hipusina e, visto também, seu envolvimento como supressor tumoral, fez com que essa proteína se tornasse alvo principal deste estudo, utilizando como modelo células de adenocarcinoma de colo de útero humano (HeLa). Resultados: Análises in silico indicam que a região supostamente hipusinada é conservada nas isoformas A e X1 (predita), mas não na isoforma B, além de ser conservada em várias espécies. Entretanto, análises por espectrometria de massas de imunoprecipitados da proteína SH2D4A endógena não foram capazes de validar a hipusinação dessa proteína, requerendo estudos futuros para sua caracterização. Em relação à validação da interação física entre as proteínas eIF5A-FLAG e SH2D4A, foi observado por immunoblotting que a proteína SH2D4A endógena também co-imunoprecipitava com o controle GFP-FLAG. Para dar início ao estudo de caracterização da proteína, iniciamos com a amplificação e posterior clonagem do gene em um vetor plasmidial. Com isso, foi possível identificar os transcritos variantes 1, 2, X1 e X2 de SH2D4A em células HeLa, seguido de validação pelo sequenciamento das amostras. A partir do sequenciamento foi possível observar que o cDNA de SH2D4A clonado apresentava algumas mutações, dentre elas a mais significativa foi observada no códon iniciador da proteína, resultando na utilização de um códon de iniciação alternativo para a produção da proteína nessas células. Além disso, a presença de uma uORF (upstream Open Reading Frame) na variante 1 de SH2D4A fez com que células HeLa transfectadas expressassem conteúdos proteicos distintos a partir das variantes transcricionais 1 e 2. A mutação sítio dirigida na uORF da variante 1 resultou em um aumento na produção da proteína em relação a variante 1 selvagem. Conclusão: Os resultados obtidos no presente estudo contribuem para a caracterização do gene e da proteína SH2D4A e sugerem que esta proteína possui características importantes, dentre as quais, mutações no gene que podem contribuir, juntamente com outros fatores, para o desenvolvimento e progressão de tumores

Abstract: Introduction: The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is involved in translation initiation and elongation and is related to transcription processes, macromolecular transit through the nuclear pore complex, mRNA decay, cell proliferation and differentiation, as well as being related to inflammatory processes, diabetes, cancer, Malaria, and viral infections such as HIV-1 and EBOV. The eIF5A protein is produced as an inactive precursor, and the hypusination of this factor is a post-translational modification essential for its activity and cell viability. Mass spectrometric assays revealed SH2D4A protein as a possible interaction partner for eIF5A-FLAG purified from HeLa cell extracts. In these assays, the peptide derived from SH2D4A showed a hypusine amino acid residue, an intriguing fact, because since the eIF5A hypusination discovery in the 1970s there is no evidence of any other hypusinated protein. SH2D4A gene is located on chromosome 8p close to some genes associated with tumor suppression. This region is deleted in patients with hepatocellular carcinoma (HCC) with poor outcomes, suggesting that depletion of SH2D4A could be involved in tumor progression. Besides, SH2D4A inhibits the STAT3 transcription factor activity mediated by interleukin 6 (IL-6) signaling pathway, inhibiting the transcription of genes involved in cell proliferation, survival, and tumor development. However, despite the strong evidence of the association of SH2D4A as a tumor suppressor, there are few studies involving this protein. Justification: Currently, it is unknown hypusine biosynthesis pathways not associated with the post-translational modification process of eIF5A and also the existence of other hypusinated proteins. Thus, evidence that SH2D4A protein could present the amino acid residue hypusine and, as well as its involvement in the inhibition of tumor progression, turned this protein the main target of this study. Results: In silico analysis showed that the supposedly hypusinated region is conserved in the isoforms A and X1 (predicted), but not in the B isoform, in addition to being conserved in several species. However, mass spectrometric analysis of endogenous SH2D4A protein immunoprecipitates was not able to validate the hypusination of this protein. Concerning the validation of the physical interaction between the eIF5A-FLAG and SH2D4A proteins, it was observed by immunoblotting that the endogenous SH2D4A protein also co-immunoprecipitated with the GFP-FLAG control. To start the characterization of the protein, we performed amplification of the cDNA by RT-PCR and subsequent cloning. Thereby, it was possible to identify the transcript variants 1, 2, X1 and X2 of SH2D4A, which was confirmed by sequencing of the samples. Analysis of the sequenced samples revealed some mutations in SH2D4A gene, among them, the most significant was observed in the start codon, which results in the use of an alternative start codon for production of the protein. Also, the presence of the uORF (upstream Open Reading Frame) in SH2D4A variant 1 downregulates the protein production from transcript variant 1 in transfected cells. In fact, a depletion of the uORF increased the protein content compared to original variant 1. Conclusion: Our results suggest these mutations in SH2D4A gene and the presence of the uORF in transcript variant 1 may contribute to the abnormal characteristics observed in this type of cells
Subject: Células HeLa
Mutação
Códon de iniciação
Genes
Language: Português
Editor: [s.n.]
Citation: TAMBORLIN, Letícia. Estudo de caracterização funcional da proteína SH2D4A humana. 2017. 1 recurso online (79 p.). Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Aplicadas, Limeira, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/330657>. Acesso em: 2 set. 2018.
Date Issue: 2017
Appears in Collections:FCA - Tese e Dissertação

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