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Type: TESE DIGITAL
Degree Level: Doutorado
Title: Functional importance of novel nucleotide variations in the CYP21A2 gene = Importância funcional de novas variações nucleotídicas no gene CYP21A2
Title Alternative: Importância funcional de novas variações nucleotídicas no gene CYP21A2
Author: Michelatto, Débora de Paula, 1987-
Advisor: Mello, Maricilda Palandi de
Abstract: Resumo: A Hiperplasia Adrenal Congênita (HAC), uma das desordens autossômicas recessivas mais frequentes, é causada pela deficiência de enzimas esteroidogênicas envolvidas na biossíntese do cortisol. Uma consequência disto é o desvio da síntese para a produção de hormônios androgênicos. Na forma clássica da HAC, a exposição pré-natal intrauterina ao excesso de andrógenos durante estágios críticos da diferenciação sexual leva à virilização da genitália externa de fetos 46,XX resultando em uma genitália ambígua ao nascimento, à pseudopuberdade precoce em ambos os sexos e à crises de perda de sal quando a atividade residual enzimática é menor que 1%. Sinais de excesso de andrógeno na forma não clássica podem ser acne, hirsutismo e desordens menstruais em mulheres jovens, contudo podem se manifestar anteriormente no desenvolvimento como: puberdade precoce, crescimento linear acelerado e maturação óssea avançada. Todavia, é bem conhecido que alguns indivíduos com HAC não clássica podem permanecer assintomáticos. Os objetivos deste projeto foram analisar o papel funcional de dez novas mutações (p.Leu12Met; p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; e p.Leu461Pro), uma nova deleção in frame (p.Gln398_Ala391del), duas mutações que foram descritas anteriormente, entretanto sem estudos funcionais (p.Ser113Phe e p.Thr450Pro) e três combinações de mutações in cis (p.Ile172Asn+p.Val358Ile; p.Val281Leu+p.Arg369Gln; e p.Asp377Tyr+p.Leu461Pro); e estabelecer uma correlação genótipo-fenótipo para as mutações investigadas in vitro. Além dos métodos clássicos para os estudos moleculares, a metodologia deste estudo incluiu a expressão das proteínas CYP21A2 normal e mutantes para os ensaios de determinação da atividade enzimática e da cinética enzimática, bem como a verificação da expressão proteica por Western blot. Estudos in vitro demostraram que uma mutação é uma variante normal do gene CYP21A2 (p.Leu12Met) apresentando atividade residual próxima de 100%, nove (p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; e p.Leu461Pro) se associam à forma não clássica leve de HAC com atividades residuais entre 35% e 95% e, três (p.Ser113Phe, p.Gln398_Ala391del e p.Thr450Pro) resultam em HAC forma clássica com atividades residuais abaixo de 4%. As três combinações de mutações in cis apresentaram efeito sinergístico na atividade residual enzimática. Este estudo permitiu uma correta correlação genótipo-fenótipo

Abstract: Congenital Adrenal Hyperplasia (CAH), one of the most frequent autosome recessive disorders, is caused by defects in steroidogenic enzymes involved in the cortisol biosynthesis. One consequence is the deviation of the synthesis towards the production of androgenic hormones. In the CAH classical form, intrauterine prenatal exposure to androgen excess in critical stages of sexual differentiation leads to external genitalia virilization of the 46,XX fetus resulting in ambiguous genitalia at birth, pseudopuberty in both sexes and salt wasting crisis when CYP21A2 residual activity is less than 1%. Signs of androgen excess in the non-classic form can be acne, hirsutism and menstrual disorders in young women but they can manifest early in development as precocious pubarche, accelerated linear growth and advanced skeletal maturation. However, it is well known that some individuals with non-classic CAH can remain asymptomatic. The objectives of this project were to analyze the functional role of ten novel CYP21A2 missense mutations (p.Leu12Met; p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; and p.Leu461Pro), one novel in frame deletion (p.Gln398_Ala391del), two mutations that has previously been identified but lacking functional studies (p.Ser113Phe and p.Thr450Pro) and three combined alleles (p.Ile172Asn+p.Val358Ile; p.Val281Leu+p.Arg369Gln; and p.Asp377Tyr+p.Leu461Pro); and establish a genotype-phenotype correlation for the mutations investigated in vitro. Besides all classic methods used in molecular studies, the methodology included the expression of normal and mutant CYP21A2 proteins for enzymatic activity assays and enzymatic kinetics as well as the verification of protein expression by Western blot. In vitro studies showed that one mutation is a normal variant of the CYP21A2 gene (p.Leu12Met) showing residual activity close to 100%; nine (p.Arg16Cys; p.Ser101Asn; p.Ser202Gly; p.Pro267Leu; p.Val358Ile; p.Arg369Gln; p.Asp377Tyr; p.Thr450Met; and p.Leu461Pro) result in mild non-classic CAH with residual activities varying between 35% and 95% and three result in classic CAH (p.Ser113Phe; p.Gln398_Ala391del and p.Thr450Pro) with residual activities below 4%. Alleles harboring two mutations in cis result in a synergistic effect on the enzyme residual activity. This study allowed the correlation between phenotype and genotype
Subject: Hiperplasia suprarrenal congênita
Proteína CYP21A2 humana
Esteróide 21-hidroxilase
Mutação
Editor: [s.n.]
Citation: MICHELATTO, Débora de Paula. Functional importance of novel nucleotide variations in the CYP21A2 gene = Importância funcional de novas variações nucleotídicas no gene CYP21A2. 2016. 1 recurso online ( 109 p.). Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia, Campinas, SP. Disponível em: <http://www.repositorio.unicamp.br/handle/REPOSIP/317142>. Acesso em: 29 ago. 2018.
Date Issue: 2016
Appears in Collections:IB - Tese e Dissertação

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